细胞染色机

为一种生物染色剂，必须同时满足两个要求：具有鲜艳透明的颜色，而且能与组织细胞相结合。染色剂分子能够显示颜色的基因，称为发色团。主要的发色团有：亚硝基和偶氮基显示的颜色较强，在染色剂中有一个这样的发色团，就可染出颜色。其他的发色团则不是这样，必须有几个发色团，有醌的分子中就有四个发色团，（2个羰基2个烯基）。 大量的合成染料都是由煤焦油蒸馏得到的，它们都是苯的衍生物，所以苯环是合成染料的基础。苯本身是无色的，但其氢原子为某发色团取代后就带有了颜色。含有发色团的苯环化合物，称为色原。 苯+发色团=色原 色原还不能很好地与组织细胞相结合，即使着了色也很容易脱去。因此仅仅具有色原还不能成为染色剂，染色剂分子中还需具备促使染色剂与组织细胞相结合的基因，这样基国在称为助色团。如—NH2 —COOH —OH —SO3H 氨基 羧基 羟基 磺酸基 氨基在溶液中形成阳离子（+），为碱性；其它羟基，羧基和磺酸基皆带阴离子（-）故为酸性。如三硝基甲苯是个色原，它虽有发色团—硝基，但因缺乏助色团，所以没有染色作用，不能称为染料。假如三硝基苯分子中的一个氢原子被羟基置换，则所生成的化合物既具有发色团而又得到了助色团—羟基，这就成了常用的酸性染料苦味酸。 这就可以看出，助色团的作用在于使色原形成盐类，可以在溶液中电离成为带电的离子，这样才能与相应的组织细胞的成份相结合。

来源：生物秀染色剂的分类一、按来源可以分为 1.天然染色剂：主要是苏木素，胭脂红，地衣红，番红花。 2.合成染色剂：是从煤焦油中提取的苯衍生物。在生物染色中还使用一些无机化合物，如硝酸银，氯化金，磺，锇酸，高锰酸钾等。 二、按主要用途分为 1.胞核染色剂：苏木素，胭脂红，甲苯胺蓝，美蓝，孔雀绿等。 2.胞浆染色剂：伊红，淡绿，橘黄G,酸性品红,苦味酸等。 3.脂质染色剂：苏丹Ⅲ，苏丹Ⅳ，苏丹黑，硫酸尼罗蓝及油红等。 三、按染色剂分子中的发色团可分为九类 1.亚硝基类：发色团为亚硝基（-NO)如萘酚缘-B。 2.硝基染料：发色团是硝基（-NO2）如苦味酸。 3.偶氮类：发色团为偶氮基（-N=N-）属于这一类的染色剂的橘黄G,刚果红,俾士麦棕和许多苏丹类的脂质染色剂。 4.醌亚胺类：这类染料含有两个发色团，一个是印胺基（-N=），一个是醌型苯环，如硫堇，美蓝，甲苯胺蓝O,硫酸尼罗蓝,中性红,碱性藏红花O，焦油紫等。 5.苯甲烷染料：发色团是醌型苯环，如孔雀缘，浅绿，碱性品红，酸性品红，结晶紫，甲基缘等。 6.山叮染料：发色团是醌型苯环，如派罗宁，伊红Y等。 7.蒽醌染料：此类染色剂含有色原蒽醌，如茜素和胭脂虫酸。 8.噻唑类。 9.喹啉类。 8，9类染色剂使用极少。 四、按染色剂的化学性质分类 染色剂的干粉是稳定的盐类，它们在溶液中则电离成酸性或碱性染色剂。如酸性染色剂，能够产生氢离子（H+)或其它阳离子(Na+),而其本身成为带负电荷的阴离子者。这类染色剂一般用于染细胞浆，如伊红Y，苦味酸，橘黄G等。碱性染色剂，能产生氢氧根离子（OH -)或其它负离子(如Cl-),而本身成为带正电荷的阳离子者。这类染色剂常用于染细胞核,如碱性品红等。 1.酸性染色剂：色原——助色团——Na→[色原-助色团]+Na+。常用的如伊红，酸性品红，苦味酸，橘黄G，刚果红，水溶性苯胺蓝，淡绿等酸性染料常用以染细胞浆等碱性成份。 2.碱性染色剂：色原——助色团——Cl→[色原-助色团]++Cl。常用的如苏木素,卡红,次甲基蓝,甲苯胺蓝,硫堇,美蓝等碱性染料常用以染细胞核等酸性成份。 严格地说，酸性染色剂的溶液并不一定呈酸性。同样，碱性染色剂的溶液也未必呈碱性。所谓酸性和碱性染色剂仅指它们电离后其分子的主要染色部分是阳离子还是阴离子。因此称为阳离子型染色剂或阴离子型染色剂更为适当。 常规H.E染色中苏木素染液的PH值约为7，此时胞核的化学成份电离产生H+，而其本身成为带电荷的阴离子，所以被阳离子型的碱性染料剂所着色。伊红染液为弱酸性。细胞的化学成份从溶液中获取H+而成为带正电荷的阳离子，因此与阴离子型的酸性染色剂（伊红）相结合，染作红色，这就是H.E染色分别显示核和胞浆的机制。 3.中性染色剂：这是酸性染色剂和碱性染色剂的复合物，又可称为复合染料。是由碱性染料（色碱的盐）和酸性染料（色酸的盐）配制而成。其中染色剂的分子很大，所以往往水中溶解度较低，需用酒精做溶剂。血液学中的血液涂片经常使用的瑞氏染色剂及姬姆萨染色剂就是这种混合染色剂。其中的各种不同成分可分剔使核、胞浆和颗粒着色。

常用染色剂及配制供组织学诊断用的优秀常规染色剂，不仅须使细胞核和细胞浆有选择性着染，也要使结缔组织着色。苏木素-伊红染色的切片适当分色，可使这些结构得以区分，胞核表现为蓝色，胞浆和结缔组织纤维呈各种色调的粉红，因此这是一种最常用的常规染色剂。 一、苏木素-伊红染色的基本原理 苏木素是最早用于生物学上的天然染色剂之一，百余年来，一直是生物学实验室最常用的组织学中细胞核的染料，它是从苏木树的树心中提炼出来的，为浅褐色结晶或淡黄褐色的粉末状物。易溶于乙醇、甘油，也可溶于热水。苏木素本身没有染色能力，它经过氧化后，能产生具有染色能力的苏木红，苏木红又称为氧化苏木素或苏木因。 苏木素变成苏木红的过程叫作“成熟”。成熟的方法一般有两种：一种是把配制好的苏木素液在开口瓶中放置两个月以上，让其在日光和空气中的氧的作用下使之氧化。故一般地盛苏木素的瓶子放在向阳处，时间愈长，染色的效果愈好。常配制一大瓶，备长期使用。另一种方法是在苏木素液中加入氧化剂，如磺酸钠，过锰酸钾，氧化汞，双氧水等。用这种方法成熟与用第一种方法者不同的是，它放置时间愈长，染色的效果愈低。这是因为苏木红被继续氧化可生成无色的化合物，故一次不宜配制过多，还应放置40C冰箱内避光保存以延长使用时间。它的优点是配制后即可使用。 成熟的苏木素对组织并无亲和力，须加入含金属离子的媒染剂，才能达到染色的目的。一般用于明矾苏木素的媒染剂为钾明矾或氨明矾。主要是利用明矾中的铝离子和苏木红结合形成的铝沉淀色素为紫蓝色，对染色质有很大的亲和力，水和酒精都不能使其褪色。用于铁苏木素的媒染剂是三价铁离子，苏木红的铁沉淀色素为黑蓝色，不溶于水，因此，故不能配制大量含媒染剂的混合液，一般用时现配，或在染色过程中，先用铁明矾媒染，然后再染苏木素，如磷钨酸苏木素染色即是。 常规苏木素染色的对比染色是用伊红，也有采用焰红，因为焰红比伊红色泽更鲜明，此外还有采用橘黄G，比布里希猩红，波尔多红等作为对比染色。 苏木素-伊红染色，在组织病理学中，是一种日常使用最为广泛的常规染色方法。一张优质的染色切片，可以清晰地观察到各种不同的组织结构以此作为病理诊断的确切依据。再根据此染色切片所见，分别进行不同的特殊染色。 二、染液的配制 在实验室内常用的苏木素染液有以下几种，不同的仅是染色时间以及比较每种染色方法彼此的优缺点，不过各有优劣。 （一）苏木素染液的配制方法如下 1.Harris氏苏木素液 甲液：苏木素 1g 无水酒精 10ml 乙液：硫酸铝钾 20g 蒸馏水 200ml 丙液：一氧化汞 0.5g 经典的配制方法是，先将甲液加热溶解后，密封待用，再将乙液加热溶解至沸，去火，待溶液仍处于小沸腾状态时再将甲液徐徐倾入其中，全部混合后，再使溶液在短时间内加热至沸腾，去火，最后，将氧化汞缓慢倾入溶液中（氧化汞一定要慢慢少量分次加入，切忌急躁。因氧化汞倒入后，溶液会迅速膨胀易沸出容器外而发生危险。）此时液体变为深紫色，待氧化汞全部放入后，再将溶液加温至沸腾片刻，立即将溶液放入流动的冷水中，并缓缓地连续摇晃至溶液完全冷却为止。隔夜后过滤，加入冰醋酸（按5%比例）混匀，再过滤后保存于冰箱内备用。 我们在实验工作中摸索了一种Harris氏苏木素的配制方法，染色效果很好，特介绍如下。 配方：（配制2000ml） 苏木素 9g 硫酸铝胺（铵明矾） 200g 氧化汞 7g（5—10g） 冰醋酸 100ml 蒸馏水 2000ml 器具： 3000毫升三角烧瓶 1个 200毫升量筒 1个 1000毫升量筒 1个 漏斗 1个（大） 滤纸 1大张 另备脱脂棉、电炉、湿抹布、大称量纸、流水槽等。 （器具要求达到化学洁净） 配法： 1．将苏木素溶于100毫升无水乙醇中，密封备用。 2．将200克铵明矾溶于2000毫升蒸馏水中，加热至沸。 3．去火。加入苏木素酒精搅拌，加热至沸。 4．去火。缓缓加入氧化汞。 5．微火煮至有金属膜产生。 6．去火。以湿抹布包住三角烧瓶的颈部。迅速放置于冷水浴中冷却，缓缓摇动烧瓶至液体完全冷却为止。 7．静置避光过夜。棉花过滤。滤液中加入冰醋酸（按5%的比例加入），混匀，滤纸过滤，备用。 注意事项： 1．配制好的苏木素液，未经使用的可长期置冰箱（冷藏）内保存。 2．盛液体的烧瓶要质优并且容积要大，防止忽速冷却对破裂和煮沸时液体溢出。 2.Hansen氏苏木素液 甲液：苏木素　　　　　　　　　　　1g 　　　无水酒精　　　　　　　　　　10ml 乙液：硫酸铝钾（钾明矾） 　　　　20g 　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　200ml 丙液：高锰酸钾　　　　　　　　　　1g 　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　16ml 　　先将甲液加热溶解，然后将乙液加热溶解，将甲、乙两液混合。再将丙液溶解后缓缓滴入，待全部混合后，再次煮沸一分钟，冷却后过滤，即可使用。 3.Heidenhain氏铁苏木素液 甲液：硫酸铁铵（紫色结晶）　　　　5g 　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　100ml 乙液：苏木素　　　　　　　　　　　0.5g 　　　无水酒精　　　　　　　　　　10ml 　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　90ml 　　此液要求硫酸铁铵只有紫色的透明结晶才能使用；苏木素是溶于洒精中然后加水。苏木素液需放置4-5周才能成熟。临用时将甲、乙两液等量混合后使用。（也可先将苏木素用无水酒精配成5%的贮备成熟，用时取10毫升加蒸馏水至100毫升使成乙液） 　　此苏木素液能染许多结构，但只能用于退行性染色法，需要熟练的分化，初学者宜用减半浓度的铁明矾分色，熟悉后再用原浓度分色。 　　此液与其它的苏木素染色技术有两个不同a.媒染剂与苏木素分开使用。b.所用的媒染剂亦用作为分色剂。 4．Ehrilich氏酸性苏木素液 主要应用一般染色和粘液，骨组织的染色 配方： 苏木素 2g 纯酒精 100ml 甘油 100ml 蒸馏水 100ml 冰醋酸 10ml 钾明矾 15g 将苏木素溶于纯酒精，再将钾明矾溶于蒸馏水中，溶解后将甘油倾人混合，然后加入苏木素酒精混合，最后加人冰醋酸，溶液全部混合后，应暴露在日光下使其自然成熟，时间约要三个月。（若加人300毫克碘酸钠，使苏木素迅速氧化则可立即使用。）此液贮存愈久染色力愈强。（可保持数年之久）染色时间5——20分钟，结果甚佳。 5．Delafreld氏苏木素液 主要应用于一般染色，弹力纤维的染色。 甲液： 苏木素 4g 纯酒精 25ml 乙液： 饱和铵明矾水溶液（约 10％）40毫升 丙液： 甘 油 100ml 甲 醇 100ml 先将苏木素溶于酒精，再将甲液混合在乙液中，置于白色瓶中并暴露在阳光下约一周，然后过滤，将丙液加人滤液中，待溶液呈暗灰色时再过滤，滤液密封保存。 6．Mayer氏明矾苏木素液 主要应用于一般染色，骨组织染色，及免疫组化染色。 配方： 苏木素 0.1g 钾明矾 5g 碘酸钠 0.02g 拘椽酸 0.1g 水合氯醛 5g 蒸馏水 100ml 先将苏木素及水煮沸溶解，加人钾明矾与碘酸钠，搅动直到全部溶解为止。再加人水合氯醛和拘椽酸，完全溶解后染液呈蓝紫色。加热煮沸五分钟，冷却后过滤即成。 此染液染切片5——15分钟，不需分化，充分水洗后，可使细胞核显蓝色并且非常细致清晰，通常用于对比染色。 7．Weigert氏铁苏木素液 甲液 苏木素 1g 无水酒精（或 95％酒精） 100ml 乙液 29％三氯化铁水溶液 4ml 蒸馏水 95ml 盐酸 1ml 临用时，取甲、乙液等量混合即可应用。混合时应将乙液加人甲液内，染液呈紫黑色。铁苏木素不能象明矾苏木素一样配制后可放置贮存备用，因铁与染色剂的色素根会化合生成不溶性沉淀，所以铁作媒染液时，必须与染液分别配制和分别保存，染片时临时混合应用。 由于这是一种铁苏木素，它将胞核染成黑色。能抵抗在对比染色液中所含分色剂的脱色作用，且不会被光线退色，因此比钾矾苏木素染色较为持久。 8．Mallory氏磷钨酸苏木素