推荐厂家
暂无
暂无
化学发光反应参与的免疫测定分为二种类型。第一种是以发光剂作为酶免疫测定的底物,通过发光反应增强测定的敏感性;第二种是以发光剂作为抗体或抗原的标记物,直接通过发光反应检测标本中抗原或抗体的含量。 一、化学发光酶免疫测定 从标记免疫测定来看,化学发光酶免疫测定(chemiluminescentenzymeimmunoasssay,CLEIA)应属酶免疫测定。测定中2次抗原抗体反应步骤均与酶免疫测定相同,仅最后一步酶反应所用底物为发光剂,通过化学发光反应发出的光在特定的仪器上进行测定。两种常用的标记酶,辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)均有其发光底物,由此建立的CLEIA均在临床检验中应用。 (一)HRP标记的CLEIA 常用的底物为鲁米诺或其衍生物。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,通常以0.1mol/LpH8.6Tris缓冲液作底物液,鲁米诺和H2O2在无HRP催化时也能缓慢自发发光,而在最后光强度测定中造成空白干扰,因而宜分别配制成2瓶试剂溶液,只在用前即刻混合。 HRP催化鲁米诺氧化的反应可被某些酚试剂(如邻-碘酚)或萤火虫荧光素酶等加强。加强剂的作用是增强发光和延长发光时间,由此可提高敏感度。 (二)AP标记的CLEIA 在以AP为标记酶的CLEIA中,应用的底物为adamantyldioxetasephosphate,有不少衍生物的商品试剂如PPD可供应用。发光反应的反应式如下:[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/08/200608290913_24989_1636364_3.jpg[/img]二、化学发光标记免疫测定 化学发光标记免疫测定亦称化学发光免疫测定(chemiluminescentimmunoassay,CLIA),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫测定方法。用作标记的化学发光剂应符合以下几个条件:①能参与化学发光反应;②与抗原或抗体偶联后能形成稳定的结合物试剂;③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力;④应不改变或极少改变被标记物的理化特性,特别是免疫活性。鲁米诺类和吖啶酯类发光剂等均是常用的标记发光剂。 鲁米诺类的发光反应须有催化剂(例如过氧化物酶)催化,且与蛋白质或肽结合后其发光作用减弱,因此鲁米诺类在CLEIA中是很好的底物,但已较少用于CLIA的标记。吖啶酯类对CLIA更为适用,其显著的优点是:①氧化反应不需催化剂,只要碱性环境中就可以进行。反应物在加入H2O2后再加氢化钠溶液,发光反应迅速,本底低。②在氧化反应过程中,结合物被分解,因此游离的吖啶酯的发光不受抑制。试剂稳定性好。 三、电化学发光免疫测定 在电化学发光免疫测定(electrochemluminescenceimmunoassay,ECLI)中应用的标记物为电化学发光反应的底物三联吡啶钌,其衍生物N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯可通过化学反应与抗体或不同化学结构的抗原分子结合,制成标记的抗体或抗原。ECLI的测定模式与ELISA相似,分二个步骤进行。以双抗体夹心法测定抗原为例,第一步在试管中进行,反应物为Ru(bpy)32+标记的抗体、吸附在磁性微球上的固相抗体以及受检的标本,反应式如图[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/08/200608290914_24990_1636364_3.jpg[/img]反应后除由标记抗体、固相抗体与标本中的抗原形成的夹心复合物外,尚有多余的标记抗体和固相抗体。第二步是将反应液输入特殊的检测仪器的反应室中(图18-3),随即用含三丙胺(TPA)的缓冲液冲洗。反应室电极下有磁铁。含磁性微球的夹心复合物及游离的固相抗体被吸附在电极表面,游离的标记抗体随冲洗液流出。此时在反应室中即发生如图18-1的电化学发光反应。发出的光由光电倍增管转为信号,通过电信号的测定反映标本中抗原的含量。[img]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2006/08/200608290915_24991_1636364_3.jpg[/img]ECLI具有以下优点:①标记物在再循环利用,使发光时间更长、强度更高、易于测定;②敏感度高,可达pg/ml或pmol水平;③线性范围宽,>104;④反应时间短,20min以内可完成测定;⑤试剂稳定性好,2~5℃可保持一年以上。 四、在医学检验中的应用 放射免疫分析因标记物的放射性在应用中存在不少问题。为替代这一广被采用的测定方法,近年来创立了多种新的标记免疫技术。化学发光免疫测定具有明显的优越性:①敏感度高,甚至超过RIA;②精密度和准确性均可与RIA相比;③试剂稳定,无毒害;④测定耗时短;⑤测定项目多;⑥已发展成自动化测定系统。因此化学发光免疫测定在医学检验中不仅能取代RIA,而且可得到更为广泛的应用。
化学发光免疫测定是将抗原与抗体特异性反应与敏感性的化学发光反应相结合而建立的一种免疫检测技术,最初建立于1976年。 (一)原理 化学发光免疫测定属于标记抗体技术的一种,它以化学发光剂、催化发光酶或产物间接参与发光反应的物质等标记抗体或抗原,当标记抗体或标记抗原与相应抗原或抗体结合后,发光底物受发光剂、催化酶或参与产物作用,发生氧化还原反应,反应中释放可见光或者该反应激发荧光物质发光,最后用发光光度计进行检测。 (二)标记物 1.发光剂直接标记 常用鲁米诺及其衍生物等,它们属环肼类化合物,能与很多氧化物如氧、次氯酸、磺、过氧化物等反应而发光。因此可直接将鲁米诺或其衍生物标记抗体或抗原进行CLIA。这类方法特异性强,但往往会因交联影响发光物特性,降低敏感性。 2.发光催化酶标记 常用辣根过氧化物酶、丙酮酸激酶、葡萄糖氧化酶等标记抗体或抗原。与酶标抗体测定基本相同,差别在于CLIA是用发光性底物指示反应,有人称为发光酶免疫测定。 3. 标记物产物参与反应 标记物不直接催化发光反应,而其反应产物能使反应系统发光。如用草酸类标记抗体或标记抗原,在有H2O2作用下,生成二噁二酮,后者可使红荧稀(Rubrene)激化发光。 (三)应用 CLIA特异性强、敏感性高,可检测到10-5mol/L的抗原量。快速,一般几十分钟或1-3小时内完成。操作简便,可进行固相和均相分析。试验重复性好,试剂易标准化和商品化。目前已用于多种药物、激素、病原微生物及其代谢产物、抗体及其他生物活性物质的测定。
工作人员被放射性同位素污染是生物医学实验中最大的危害之一,为了在操作过程中确保安全,有许多严格的规定和要求。虽然在通常实验中所用同位素的量相对地讲是低的,但这些预防措施必须严格遵守。现对从事这一工作的一些原则作一简述,多半是一些普通的常识,但在执行时往往容易忽略而造成严重的后果。 1.放射免疫实验室中的放射性危险 对于没有封闭的放射性物质,主要的危险有下面三种: (1)β-或γ-射线的外照射 在放射免疫测定实验中,这方面的危险不大,因为放射性同位素的使用总量相当小,最常用的125I,它的能量也较小(0.027MeV),因此,其穿透能力是很小的。 (2)皮肤污染 这是在放射免疫测定中最常见的危害。高剂量的污染会导致皮肤的坏死,更为严重的是由于不注意手上污染的同位素而非常容易随着吃东西进入体内,随后又分布到全身。 (3)同位素进入人体 这是最主要的危险,通常是由于被那些皮肤或衣服上污染了同位素的人制作食品和饮料所致。同样也可能从空气中吸入。因为125I集中于甲状腺会导致甲状腺严重坏死,而且在体内长期受125I放射损伤还会导致癌症。 2.管理总则 对于操作放射性同位素的实验室应该这样设计:这些实验室应该符合使用和贮存同位素的要求。实验区域应该用国际上所接受的警告标志显示。在一些较大的实验室,对于操作大剂量放射性同位素(1mCi)的设计应该进行特别的审查。实验室内应该有通风良好的通风橱,而且还应该有淋浴的地方以便对可能出现的皮肤污染及时冲洗。对于一些没有经过同位素安全知识训练的人员不能允许进入实验室。 每一个实验室,即使是小实验室,应该指定专人(RSO)负责安全检查,此人将对有关人员进行同位素使用的安全教育,定期检查工作人员和仪器的污染情况,并帮助处理一些事故。该人对进入实验室的的所有放射性物质负责,并按照有关法令来处理同位素。 3.标记规则 下面的规则适用于所有水平的同位素标记工作。 (1)在实验室必须穿上带有从事同位素工作标记的实验服。(2)不准在实验室里吃、喝和抽烟。(3)如果溶液的放射性强度超过0.1μCi/ml,或虽然溶液中放射性强度较低,但总的放射性超过10μCi时,操作时均需戴上手套。(4)当操作的剂量大于1mCi时,手必须要用放射监测仪进行测定,这包括移去手套前后均需测定。(5)所有放射性材料,其浓度大于0.01μCi/ml或总放射强度大于1μCi时,均须标上同位素标签,标明强度、日期和体积; (6)不准用嘴来吸移液管; (7)应该尽可能采用有防护物的吸管装置; (8)所有操作台面需有保护层覆盖,并定期检查,在必要时把保护层换掉; (9)放射活性大于0.1mCi时,所有操作应在盘中进行,并在用过以后立即进行检查; (10)对于非消耗性设备(柱、注射器、吸管),若使用过高剂量放射活性材料后,必须在使用后用自来水冲洗,并浸泡在有去污剂的溶液中,直到下次再用,那些设备应该指定放在同位素实验室,不允许拿到别的地方再去使用;