实时定量系统

【仪器心得】实时荧光定量PCR仪使用心得 在生物科学研究领域，实时荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）技术已经成为不可或缺的一部分。这一技术不仅具备高灵敏度、高特异性和高精度的特点，还能够对DNA或RNA进行定量分析，为基因表达分析、病原体检测、遗传病诊断以及药物研发等领域提供了强大的支持。作为一名分子生物学研究者，我对于实时荧光定量PCR仪的使用有着深刻的心得体会，以下将结合技术原理、特点、应用场景以及个人见解，为大家详细介绍这一强大的科研工具。 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/10/202410121429543053_6906_6748942_3.jpeg实时荧光定量PCR仪技术详解原理 实时荧光定量PCR技术基于PCR（聚合酶链式反应）的基本原理，通过不断循环的变性、退火和延伸步骤，实现DNA或RNA的指数级扩增。与常规PCR不同的是，实时荧光定量PCR在反应体系中加入了荧光染料或荧光探针，这些荧光物质能够与扩增产物特异性结合，并在特定波长光的激发下发出荧光。随着PCR反应的进行，荧光信号逐渐增强，仪器通过实时监测荧光信号的变化，可以绘制出扩增曲线，进而对样本中的目标核酸进行定量分析。 特点 1. 高灵敏度：实时荧光定量PCR技术能够检测到极微量的目标核酸，使得其在低丰度基因表达分析、病原体微量检测等方面具有显著优势。 2. 高特异性：通过设计特异性的引物和探针，实时荧光定量PCR可以实现对目标基因的精确识别，避免了非特异性扩增的干扰。 3. 高精度：结合先进的荧光信号检测技术和数据分析算法，实时荧光定量PCR能够提供准确的定量结果，有助于科研工作者进行精确的数据分析和比较。 4. 快速便捷：现代实时荧光定量PCR仪通常配备有高效的热循环系统和自动化的样品处理功能，大大缩短了实验时间，提高了工作效率。 应用场景 实时荧光定量PCR技术在生命科学领域的应用广泛而深入。在基因表达分析中，它可以用于检测不同组织、不同发育阶段或不同处理条件下基因的表达水平变化；在病原体检测中，它能够快速准确地识别并定量病原体核酸，为疾病诊断和治疗提供重要依据；在遗传病诊断中，实时荧光定量PCR可以检测基因突变、基因缺失或基因重复等异常情况；此外，在药物研发、环境监测和食品安全等领域，实时荧光定量PCR技术也发挥着重要作用。 个人使用心得与推荐 作为一名长期使用实时荧光定量PCR仪的科研人员，我深刻体会到了这一技术带来的便利和优势。在使用过程中，我注意到以下几点对于获得准确可靠的实验结果至关重要： 1. 样本处理：样本的纯净度和完整性对于实验结果至关重要。因此，在进行实验前，需要对样本进行严格的预处理和质量控制，以确保样本中的目标核酸不受污染和降解。 2. 引物和探针设计[size=14px]：引物和探针的特异性是实时荧光定量PCR技术成功的关键。在设计引物和探针时，需要充分考虑目标基因的序列特征、潜在的二级结构以及可能的非特异性扩增等因素，以确保实验的准确性和可靠性。 3. 仪器选择和校准：不同品牌和型号的实时荧光定量PCR仪在性能上可能存在差异。因此，在选择仪器时，需要根据实验需求和预算进行综合考虑。同时，定期对仪器进行校准和维护也是确保实验结果准确性的重要措施。 4. 在我个人的使用体验中，某品牌的实时荧光定量PCR仪给我留下了深刻印象。该仪器不仅具备高效的热循环系统和精准的荧光信号检测系统，还配备了智能化的操作界面和数据分析软件，使得实验操作更加便捷、数据分析更加准确。此外，该仪器还支持多种荧光通道和反应体系的选择，能够满足不同实验需求。 https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2024/10/202410121429546220_2116_6748942_3.jpeg结语 实时荧光定量PCR技术作为生命科学领域的重要工具之一，其高精度、高灵敏度和高特异性的特点使得它在众多研究领域都发挥着不可替代的作用。通过深入了解实时荧光定量PCR仪的原理、特点和应用场景，并结合个人使用心得和推荐，相信广大科研工作者能够更好地利用这一技术，探索生命科学的奥秘，推动科研事业的进步和发展。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ， PCR）自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，不仅建立了一系列的方法，而且也诞生了许多与这些方法相匹配的新型热循环仪和实验材料。实时定量PCR(real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术，所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。目前它作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达一千多篇。实时PCR技术较之与以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。另外，它还可以通过不同的引物设计在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，即多重扩增。本文将对实时定量PCR目前的应用状况、仪器应用、新材料进展以及实验条件的优化作一综述。实时定量PCR的应用现状实时定量PCR技术自1996年诞生以来，由于它显著的优越性，不仅广泛的应用于分子生物学的各个研究领域，而且也开始作为一种诊断手段应用于临床。其应用涉及到的范围包括DNA、mRNA和病毒荷载量的定量，核酸多态性分析，基因突变分析等多个领域。Giulietti 等人对用实时定量PCR测定细胞因子基因的表达作了详细的描述。细胞因子是一种调节蛋白，它对免疫反应、炎症反应具有重要的调节作用，其量的改变常常与一些疾病，如炎症反应、自身免疫性疾病、移植排斥有密切的关系。由于所得到组织样本常常因为太小而不能满足在蛋白质水平的检测，另外，通常用的蛋白质检测方法（如ELISA）的灵敏度也难以完成对极微量的蛋白产物的检测，所以应用PCR定量进行基因诊断就显得十分有意义。众所周知，cDNA微排列和差异表达PCR技术是对基因表达变化分析的两种关键技术，但是这两种技术只能对基因表达变化进行定性分析，而不能进行定量分析。Rajeevan等人利用实时定量PCR技术却成功地将基因表达的变化进行了量化，不仅有效地证明了上述两种方法的有效性，而且提供了一种具有高通量的对基因表达变化进行检测的新技术。实时定量PCR技术的出现不仅增强了有关对基因量变化的研究方法，而且也增强了对基因质所发生变化方面的研究。例如Laird和他的同事们建立了一种被称作Methylight的实时定量PCR方法，它能通过特异的引物和/或Taqman探针检测基因CpG岛的胞嘧啶是否发生了甲基化。由于实时PCR的敏感性和特异性，使得这种方法对胞嘧啶的过度甲基化常常具有极高的灵敏度。最近有研究表明这种方法可以从食管癌病人的食管粘膜中检出含有发生了过度甲基化基因的细胞。又如Sevall等人证明可以用实时定量PCR方法区分含有突变的等位基因。这是利用两种不同的荧光报告基团标记Taqman探针，该探针既可同野生型基因又可同突变型基因发生杂交，由于探针的杂交效率及随后的切割是由杂交决定的，所以如果出现一种信号强于另一种信号则表明两条基因具有同源性，若两种信号都增强则表明为异源性。目前实时定量PCR在临床诊断方面的应用主要体现在对感染组织或细胞负载病毒的定量测定上，这一技术对DNA和RNA病毒都可以检测，目前已有标准的操作手册供人们使用，但是必须明确，国际上既没有统一的病毒荷载的标准，也存在着对其标准曲线和定量准确性的各种争论。这里值得一提的是一种称为NASBA（nucleic acid sequence-based amplification）的技术，它是一种利用电化学以光的等温PCR反应，在反应过程中能产生一种与靶RNA反极性的RNA扩增子，分子beacon常用于这种技术 ，这种方法常常用于对逆转录病毒的定量测定。常用的热循环仪对PCR产物进行实时定量的测定之所以能成为现实，并且应用如此广泛，其中一个重要的原因就是新的热循环仪的研制与推广。目前，国内外常用的热循环仪主要有以下几种：一、PE公司生产的Applied Biosystem系列1、 ABI Prism 7700 Sequence Detection System (SDS)是第一种作为商业用途的实时PCR测定仪，它由激光激发荧光，并且可在500-660nm范围内调节波长，可以用于基于水解探针、双链DNA结合染料、分子beacon原理的分析。一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样本的完成只耍要2小时。但是它不能实时对扩增结果进行分析，而只能在全部扩增结束后才进行数据分析。2、Gene Amp 5700 SDS: 它的基本工作原理和操作与ABI Prism 7700 SDS相同，但是它是利用卤素灯为激发光源，而且只设计了一个检测波长。3、ABI Prism 7900 SDS: 这是一种为实现高通量检测而设计的仪器，其基本构成与ABI Prism 7700 SDS相同，但程序设计完全实现自动化要求，而且有两种样品盘可供选择（96孔和384孔）。如果加上一个装载辅件，可以在24h之内完成84个384孔板的样本测定。二、Roche 公司生产的Lightcycler热循环仪，它以能装载20-25ul的毛细硅管作为反应管进行扩增，光源选用冷光源系统，可以减少光源对样本的影响。由二极管发射蓝光激发荧光，并提供三个滤光片，可利用荧光分光测定的原理，同时对一个反应体系的多种荧光进行检测，所以它完全可以进行多重PCR.由于Lightcycler使用了其独特毛细管反应体系和空气快速热循环系统，使样本能在非常短的时间内有效地实现温度变化，从而能在20-30min内快速完成30-40循环，达到样本扩增的目的。Lightcycler通常使用的实验材料主要是SYBRI Green I荧光染料和Taqman荧光探针和杂交探针。虽然Lightcycler有相当多的优点，但是这也有一些不足之处，由于它只提供一个32孔的样品盘，这使得不能在一次进行较多的样本测定。三、Bio-rad 公司生产的iCycler iQ：这种仪器提供连续的检测波长调节，程序满足实时数据处理，可以同时在一个反应体系中检测四种荧光信号，由于一批能完成96个样本的测定，所以能提供相对较快的扩增反应。四、Strategene公司的MX4000 Multiplex: 这种仪器的检测波长可在350-750nm范围内进行调节，以卤素灯作为激发光源，常选用的实验材料包括Taqman探针、杂交探针和分子信标（molecular beacon），其样品盘的规格有多处可供选择，包括96孔盘、8联管或单管，其程序也提供实时数据分析。五、Cepheid公司的Smart Cycler System: 这种仪器正如其名一样具有强大的功能，它有16种反应模式可供选择，而且每种模式都有各自的程序，任一模式不仅能同时检测四种荧光信号，而且不同的使用者可对同一批样品同时运行不同的模式进行检测。Smart Cycler System的这种设计虽然有其优点，但是其缺点也是显而易见的，由于其将样品盘分得过细，所以不利于同时进行较多样品的分析。六、Corbert Research 公司的Rotor-Gene: 这种仪器与Lightcycler相比，属于中心型热循环仪，即从反应体系内部进行热变化；其具有双光源系统，蓝光在470nm处激发荧光，绿光在530nm波长激发荧光；具有两种样品盘（32孔和72孔）供选择；可以对多种荧光材料进行测定

[url=http://www.f-lab.cn/pcr/rpcr-m8.html][b]便携式实时荧光定量PCR仪rpcr-m8[/b][/url]是一款便携式实时荧光定量PCR检测系统和实时PCR仪,为客户提供高效而精确的PCR测试结果,在任何时间,任何地点都能快速提供PCR检测能力。[b]便携式实时荧光定量PCR仪rpcr-m特点[/b]:●便携式：12V直流，高效节能。●用户友好：简单的界面。●小尺寸：便携式设计,可携带到任何地点工作,也可用实验室台面,只有2.1kg 。●灵敏度高：低至1COPY。●样本容量：8x0.2ml PCR管●两个通道：SYBR/FAM, ROX/Texas Red[img=便携式实时荧光定量PCR仪]http://www.f-lab.cn/Upload/RPCR-M8.jpg[/img]●开放系统：与大多数商业试剂兼容。[b]便携式实时荧光定量PCR仪rpcr-m规格参数[/b]光源：高功率LED探测器：光电二极管探测器加热/制冷模式：peltier最大升温速率：最大3℃/s热均匀性：+/-0.2℃温度精度：+/-0.2℃温度范围：4-100℃样品类型：8孔反应容积：10-150微升加热时间：1分钟探测灵敏度：1copy高分辨率融化：支持最高分辨率为0.5℃倍增性能：可探测2种染料,同时探测470/520nm(SYBR/FAM)和565/625nm(ROX/Texas Red)尺寸： 205x190x98mm重量：2.1kg计算机要求：WIN7,WIN8或Win2000工作温度：15-30℃工作湿度：15-90%更多PCR仪请浏览官网：[url]http://www.f-lab.cn/pcr.html[/url]