酯酶

密理博（Millipore）公司作为全球生命科学领域的策略性供应商，为生物科学研究和生物制药工业提供技术、工具和服务。2007年11月20日，密理博正式宣布拓宽P13激酶产品线，使其成为目前全球最丰富的脂质激酶产品线。密理博目前提供17种脂质激酶，既可以从市面上购买，也可以参加金标准激酶服务。其他没有一家公司可以提供如此品种繁多的激酶。 脂质激酶是一种新兴的且发展前景良好的潜在药物靶标，P13激酶可以调节各种细胞功能，包括细胞生长、增殖、分化、迁移、生存和细胞间通信。因此，P13激酶功能缺陷会导致多种疾病，包括多种形式的肿瘤。密理博新开发的脂质激酶组合和激酶服务提供切断细胞通信的工具，是开发新疗法的关键步骤。 和密理博卓越的PI3激酶HTRF™ 分析方法、激酶服务和小分子抑制剂相结合，新增的脂质激酶组合为研究者提供脂质激酶信号通路研究的最完整解决方案。新增的脂质激酶组合包括野生型和疾病相关突变型。 密理博作为全球领先的生命科学公司，为生物科学研究和生物制药研发提供前沿的技术、工具和服务。作为策略性合作伙伴，我们携手客户共同面对人类健康问题的挑战。从科研、开发到生产，我们的科学专家和创新的解决方案帮助客户处理最复杂的问题以帮助他们达到预期目标。 了解具体促销信息，请浏览密理博中国主页：www.millipore.com/cn。了解更多产品信息，请浏览密理博全球官方网站www.millipore.com，或拨打亚洲区技术服务热线：400-889-1988。

中药资源丰富，历史悠久，在预防与治疗疾病中扮演着重要的角色。然而，中药的化学成分多种多样，作用机制更是复杂多样，如何从中药中筛选疾病相关药效物质是当前亟待解决的关键问题。大量研究表明，人体许多疾病过程都与体内生物酶调节作用相关，如痛风[1]、阿尔茨海默症[2]、糖尿病[3-5]等。而且，中药在治疗各种疾病中也扮演着重要角色，如白芷提取物能促进新生血管形成与成熟，从而提高自发2型糖尿病小鼠创面愈合速率和质量[6]；绞股蓝叶水提物能够降低链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的血糖，其作用机制可能与增加骨骼肌肌膜葡萄糖转运体4蛋白表达和抑制骨骼肌炎症有关[7]。因此，基于酶在疾病发生发展的重要性，以酶为靶点从中药中筛选新药是一有力途径，而且开发一种快速、高效的酶抑制剂筛选方法是当前首要任务。固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的，该技术利用物理或化学方法将游离酶固定在相应的载体上用于筛选酶抑制剂。固定化酶技术可以有效提高酶的催化性能和操作稳定性，并降低成本，是目前广泛使用的技术[8]。此外，相比于游离酶，固定酶更有利于酶-配合物的分离纯化，在pH耐受性，底物选择性，热稳定性和可回收性等方面表现出优越的性能[9-10]。不同的酶发挥催化作用的活性部位不同，将酶进行固定时，要使载体材料与酶的非活性部位结合，才可以保留酶的活性，因此载体材料的选择是固定化酶技术发挥作用的关键。本文以固定载体材料（表1）为分类综述了近10年固定化酶技术在中药酶抑制剂[α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，α-Glu）、脂肪酶等] 筛选中的研究现状，希望可以为后续的相关研究提供一定的参考依据。1 磁性载体磁性载体材料是利用铁、锰、钴及其氧化物等化合物制备的一类具有磁性的材料[11]，通过改变磁力大小和外部磁场的方向来改变粒子的运动轨迹，从而使酶与载体的结合与分离可以在可控条件下完成，便于固定化酶的分离和收集，并用于酶抑制剂的筛选[12]。以磁性载体为材料的固定化酶技术的最大优点在于利用磁力吸引可使固定化酶快速从反应体系中分离，且固定化方法简单，能有效减少筛选时间及实验试剂的消耗。因此，通过不同方法对磁性载体材料进行功能化修饰，在充分发挥磁性材料优势的基础上改善其表面性质，提高对不同类型目标物的特异性，从而在各类复杂样品的前处理过程中有着良好的应用潜力[13]。目前，磁珠是近年来发展起来的一种常用的磁性载体材料，也叫做磁性纳米粒子，包括氧化铁（Fe3O4和γFe2O3）、合金（CoPt3和FePt）等。其中，Fe3O4纳米粒子具有生物相容性和无毒性等优点，被广泛应用于酶的固定化。中药酶抑制剂筛选中的常用磁珠其磁核以Fe3O4纳米粒子为主，壳层为二氧化硅、琼脂糖、葡聚糖等，是具有超顺磁性的小球形磁性粒子[14-15]，可借助外部磁场从生物催化体系中分离酶抑制剂。该方法机械稳定性高、孔隙率低，利于降低反应中的传质阻力，提高了固定化酶的重复使用性。由于其具有操作稳定性高、磁响应强、磁分离速度快等优点，在生物和药物研究中得到了广泛的应用[16]。在进行酶抑制剂筛选时，磁珠的修饰位置不同，所固定的位点也不同。因此，在实验中，往往要根据靶蛋白的分子结构选择合适的磁珠或将某一磁珠进行修饰后作为固定载体。将酶固定在合适的磁珠上会增强酶与待筛选酶抑制剂的亲和力，利用磁力将固定化酶及其抑制剂从提取液中分离，然后洗去与酶不相互作用的化合物，随后可得到酶固定化磁珠配体配合物，最后通过洗脱溶剂使配体释放进而通过质谱表征[17]。在这种方法中，潜在的配体与酶相互作用，生成酶配体配合物，这有利于利用磁性[18-23]从复杂混合物中分离活性化合物。在酶抑制剂的筛选中，磁性载体材料是最常用的固定化载体材料[24-30]。1.1 无机载体材料二氧化硅是磁性纳米粒子表面修饰最常用的无机材料[23,31-34]，此外还有二氧化钛[35]、介孔二氧化硅[16]等。Li等[23]首先将Fe3O4分散在水中加入聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）室温搅拌得到产物。然后在超声作用下将产物分散在含有异丙醇和氨水的混合溶剂中，室温搅拌下缓慢加入正硅酸乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS）溶液得到SiO2@Fe3O4磁性微球，并加入3-氨丙基三甲氧基硅烷（3-aminopropyltrimethoxysilane，ATPES）对其表面进行改性。最后将α-淀粉酶固定在表面改性的SiO2@Fe3O4磁性微球上。将制得的酶固定化磁性微球用于黄花草中α-淀粉酶抑制剂的筛选，最终得到3种黄酮类化合物对α-淀粉酶具有较好抑制作用。Liu等[35]采用溶剂热法（也称水热法或水热合成法）制备了Fe3O4@TiO2纳米粒子，并通过静电相互作用固定脂肪酶。采用透射电镜、傅里叶变换红外光谱和X射线衍射等方法对磁性纳米粒子进行表征，以确定脂肪酶是否已经被固定。研究中应用脂肪酶固定化Fe3O4@TiO2纳米粒子从6种具有脂肪酶抑制活性的藏药中筛选出脂肪酶抑制剂，获得5种具有与临床常用减肥药物奥利司他活性类似的化合物，其中1种化合物（山柰酚）的抑制活性优于奥利司他。Yi等[16]将谷胱甘肽S-转移酶固定在介孔二氧化硅磁性微球表面筛选紫苏中的酶抑制剂，利用高效液相色谱和四极飞行时间质谱法进行鉴定，筛选出6种具有谷胱甘肽S-转移酶抑制作用的物质，其中，迷迭香酸、(−)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和 (−)-表儿茶素-3-没食子酸酯具有较好的抑制活性。最后利用分子对接技术确定潜在抑制剂与谷胱甘肽S-转移酶的结合方式。首先，用FeCl3与柠檬酸三钠和乙酸钠合成Fe3O4，然后将其分散在含有乙醇、去离子水和氨水的混合溶液中，搅拌均匀后加入TEOS制得SiO2@Fe3O4磁性微球。为进一步合成介孔二氧化硅磁性微球（mSiO2@SiO2@Fe3O4），将SiO2@Fe3O4磁性微球分散在十六烷基三甲基氯化铵、去离子水和三乙醇胺中并滴加TEOS，产物用磁铁分离并清洗除杂后得mSiO2@SiO2@Fe3O4磁性微球。最后用PDA对mSiO2@SiO2@Fe3O4磁性微球进行表面改性并将谷胱甘肽S-转移酶固定在其表面。1.2 有机载体材料在酶抑制剂的筛选中，有机载体材料相比于无机载体材料应用较少。目前，用于磁性纳米粒子表面修饰的有机载体材料有聚酰胺（polyamidoamine，PAMAM）[36]、共轭-有机骨架[37]和金属-有机骨架[38]等。Jiang等[36]以PAMAM包覆磁性微球为基础，建立了一种筛选和鉴定赤芍提取物中α-Glu抑制剂的方法。首先，采用微修饰法合成了Fe3O4-COOH微球。然后，通过Fe3O4-COOH微球表面羧基与PAMAM氨基的偶联反应，制备了Fe3O4@PAMAM微球。最后，通过GA的交联，成功地将α-Glu连接到其表面。结果表明，没食子酸和(+)-儿茶素对α-Glu均具有较好抑制作用。Zhao等[37]将乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AchE）固定在适配体功能化磁性纳米颗粒共轭有机骨架上构建固定化酶反应器，并将该方法用于酒石酸、(−)-石杉碱A、多奈哌齐和小檗碱4种AchE抑制剂抑制活性的测定，发现酒石酸的IC50与已报道的结果相当，证明了该固定化酶反应器的可行性。Wu等[38]将α-Glu固定在磁性纳米材料Fe3O4@ZIF-67上，构建了快速筛选α-Glu抑制剂的生物微反应器。然后，将酶生物微反应器通过外加磁场固定在连接高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）和微注射泵2端的管中，形成一个磁性在线筛选系统。以信阳毛尖粗茶提取物为实验对象，对该在线筛选方法进行验证，利用该在线筛选系统筛选出3种抑制剂（儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子酸酯）。与传统方法相比，该方法可将筛选、洗脱和分析结合起来，可以简单、高效、直接地从天然来源筛选和鉴定潜在的α-Glu抑制剂。磁珠分散性好，磁分离速度快，酶结合量大，酶活性高，是固定化酶的理想载体，现已广泛应用于酶抑制剂的筛选中。将酶固定在特定的磁珠上，可实现酶抑制剂的分离。此方法操作较稳定，非特异性结合率低。因此，酶固定化磁珠技术因其快速的生物分析、导向性分离和从复杂混合物中直接捕获配体而受到越来越多的关注。2 非磁性载体2.1 无机载体材料2.1.1 石英毛细管 毛细管电泳（capillary electrophoresis

“美国呼吁禁止向中国出售更多芯片设备，荷兰抵制。”美国彭博社22日以此为题报道称，荷兰外贸与发展合作大臣施赖纳马赫尔当天表示，在向中国出售芯片设备的问题上，荷兰将捍卫本国的经济利益。报道评论说，荷兰高级官员的这一表态再度表明，荷兰不愿顺从华盛顿切断中国半导体技术供应的企图。彭博社报道：美国呼吁禁止向中国出售更多芯片设备，荷兰抵制为限制中国，荷兰光刻机生产企业阿斯麦（ASML）最近一段时间成为美国政府施压的对象。据报道，施赖纳马赫尔22日对议员表示，在美国与其他盟友进行贸易规则谈判的过程中，荷兰将在阿斯麦向中国出售芯片设备的问题上作出自己的决定。“重要的是我们要捍卫自己的利益——我们的国家安全，以及我们的经济利益。”施赖纳马赫尔说，如果荷兰将光刻机的问题放进“欧盟的篮子”与美国谈判，结果就是他们把极紫外线（EUV）光刻机送到美国人手中，“我们的情况会更糟”。彭博社介绍称，极紫外线（EUV）光刻机是阿斯麦生产的高端芯片制造设备。这并非施赖纳马赫尔首次就芯片制造设备对华出口问题发声，18日接受新鹿特丹商报（NRC）采访时，她表示美国不应指望荷兰毫无异议地采纳其对华出口限制措施，“荷兰不会一比一照搬美国（对华出口）的措施”。施赖纳马赫尔当时表示：“我们会做出自己的评估——我们是在与日本和美国等伙伴国家磋商后做出这一评估的。”她同时提到：“我们的出口许可政策已经有了限制。”施赖纳马赫尔称，荷兰可能自行对中国采取某些出口管制措施，但她没有对此进行具体说明。据美媒此前报道，美国于10月7日出台一系列新规，禁止将使用美国设备制造的某些芯片销售给中国。多家西方媒体报道称，美国也在鼓动和拉拢盟友加入打压中国半导体的阵营。彭博社提到，美国负责工业和安全的商务部副部长艾伦埃斯特维兹本月将前往荷兰讨论出口管制问题。美方不仅施压荷兰政府拒绝批准阿斯麦公司向中国出售最先进的光刻机，还一直试图要求禁止该公司对华销售部分旧款光刻机。外媒此前报道称，受美国对华出口禁令影响，阿斯麦第三季度订单有所减少。对于拜登准备向日本荷兰施压阻止芯片技术流向中国一事，中国外交部发言人赵立坚11月7日表示，美方此举不是堂堂正正的大国所为。当然，美方滥用国家力量，倚仗技术优势，对盟国经济胁迫，以维持自身霸权私利，早已不是什么新鲜事。美方将科技和经贸问题政治化、工具化、意识形态化，对别国搞技术封锁、技术脱钩，其用心人尽皆知。企图堵别人的路，最终只会堵死自己的路。我们希望有关方面秉持客观公正立场，从自身长远利益和国际社会根本利益出发，独立、自主地作出正确判断。彭博社22日报道提到，欧盟谈判代表正与美方就一些有争议的贸易问题进行磋商。以法国为代表的一些国家表示，（美方）的相关措施可能损害欧洲经济，并表示可能向世界贸易组织提起申诉。这些问题将成为下月初欧盟和美国官员举行的高级别会议——贸易与技术理事会上的话题。