噁吖啉

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上的文章，Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting 1。该文章的通讯作者是美国百时美施贵宝的Jason M. Hogan研究员。抗体药物结合表位的测定是药物开发的重要环节。抗体的结合位点决定了它的药理学和药代动力学特性。本文采用化学印迹法结合质谱技术对MICA蛋白上的抗体结合表位进行了测定，单残基水平的分辨率能够展现更精细的结构信息。作者选择了两种包含有双吖丙啶基团的光催化标记试剂TDBA和3-azibutanol（如图1AB中的化学结构式）。在紫外光照射下，双吖丙啶基团会形成较高反应活性的卡宾中间体插入到氨基酸的X-H键中（X=C, O, N, S）中，进而实现较高水平的标记序列覆盖和结构分辨率。值得注意的是，TDBA和3-azibutanol在分子尺寸、极性以及对不同氨基酸的反应活性上都存在差异，因此两种试剂获得标记结果往往能展现一些互补的结构信息。作者首先对MICA与Fab-1的互作表位进行了测定。由于同一条肽段存在多个标记位点，每个位点的标记比例变化也不一样，所以肽段水平的标记往往反映是该肽段连带区域结构平均化的结果。图1AB为MICA与Fab-1结合后标记比例的变化。在MICA α3结构域中，共有34个残基被TDBA试剂修饰(图1A)。在这些残基中，发现18个位点的标记量在与Fab-1形成复合物后显著性地下降，3个位点的标记量显示出增加。如果按照肽段标记水平的变化来看，其中5个位点的结构变化信息则会被掩盖。相较于肽段标记量变化，计算单个残基的标记量变化能将抗体结合表位锁定到更精确的位置。将标记量下降的残基映射到MICA蛋白晶体结构上(图1C)，可以观测到大多数受保护的残基在α3结构域上形成了一个连续的表面。其中一个残基Q278显示出标记量增加，并且靠近TDBA定位的表位，表明它可能位于表位边缘或附近。其余差异标记残基位于远离表位的区域，可能是Fab-1结合时蛋白质结构构象变化导致的结果。在3-azibutanol的实验中，复合物形成后仅显示5个标记量显著性下降的残基和2个增加的残基(图1B)。四个标记量下降的残基R279、Y283、E285和H290在TDBA标记实验也观察到。两种标记试剂的测定结果可以相互验证，同时互相补充。3-azibutanol定位的表位覆盖了TDBA表位中的两个不连续区域(图1D)。整合两种标记试剂定位的表位区（图1E），对比X-射线晶体学测定的表位（图1F）发现大多数通过卡宾化学标记鉴定的表位残基被晶体结构证实，其余残基则位于晶体学表位外围的8Å范围内。以上结果均说明卡宾化学印记法在测定抗体结合表位上具有较高的准确性。图1 MICA与Fab-1的互作表位测定：A)TDBA, B) 3-azibutanol实验标记量的变化；使用C) TDBA, D) 3-azibutanol 定位的表位；E)整合标记试剂测定的表位；F) X-射线晶体学测定的表位。鉴于此，作者将卡宾化学印记法应用到了其他候选Fab与MICA结合表位的测定上。在实验开始之前，作者首先用生物膜层干涉（BLI）技术对几个Fab在MICA上的竞争结合关系进行了考察。如图2A所示，Fab3、Fab4、Fab5存在着竞争结合，表明它们结合的表位一致或表位之间存在重叠。而Fab1、Fab2与MICA结合相对独立，不受其他Fab的干扰，说明Fab1和Fab2都具有各自单独的结合表位。尽管生物膜干涉能够展现各个Fab结合表位的位置关系，但却无法实现更高分辨的定位。表面标记法则能很好地解决此问题。如图2B-G，通过卡宾化学印迹法的测定6个Fab的结合表位都实现了准确定位，位置接近或重叠的表位则会产生竞争结合，因此更精准地解释了Fab间的竞争关系。此外，作者还将卡宾化学印记法应用到了完整抗体Ipilimumab与CTLA-4结合表位的测定（图3），卡宾化学印迹法依旧展现出较高的分辨率，准确描绘出了Ipilimumab与CTLA-4结合表位轮廓。图2 A）通过生物膜层干涉测定6个Fab的竞争结合关系；B-G）卡宾化学印记法测定6个Fab的表位图3 卡宾化学印记法测定全长抗体Ipilimumab与CTLA-4互作表位总之，使用卡宾化学印迹可以快速定位抗体结合表位，以支持抗体药物的开发。两种标记试剂的使用增加了蛋白复合物表面标记残基的覆盖率，可提供互补结构信息。残基水平的标记细化了相互作用表面并且能够区分与结合表位不相关的远端调控。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting参考文献1. Hogan JM, Lee PS, Wong SC, et al. Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting. Anal Chem. 2023 95(8):3922-3931.

大家好，本周为大家分享一篇2023年发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，μMap Photoproximity Labeling Enables Small Molecule Binding Site Mapping1。该文章的通讯作者是来自美国普林斯顿大学化学系的David W. C. MacMillan教授。　　目前，药物发现主要分为两种方式：基于靶点的药物研发(Target-based drug discovery，TDD)和基于表型的药物筛选(Phenotypic drug discovery, PDD)。表型筛选主要是在细胞或动物水平开展实验，因此蛋白靶点以及蛋白-配体结合模式一开始就是未知的，如何在确定活性分子后快速地找到其作用通路、靶点、结合位点、结合模式(正构/别构)一直以来都是众多研究员所关心的问题。常规的蛋白质组学差异性分析能够帮助我们快速确认作用通路、发现潜在靶点，但却缺少更精细的结构信息。光亲和标记(Photoaffinity Labeling)能够有效地补充这方面的信息，将PAL探针靶向交联至靶蛋白结合口袋，再利用LC-MS去寻找标记位点或肽段，从而提供肽段或残基分辨率的结合位点信息。然而，由于PAL探针与蛋白是按照一定的化学计量比进行结合的，所以产生的标记信号和序列覆盖都非常有限。除此之外，每个PAL探针都有不同的二级碎裂模式，使质谱分析复杂化。基于此，David W. C. MacMillan团队开发了一种稳健且通用的光催化标记方法来定位蛋白结合位点。　　如图1B所示,活性分子上连接有具有光催化功能的标签(Catalytic tagging)，本文使用的是铱光催化剂。活性分子-铱光催化剂偶联物能够靶向至蛋白的结合口袋，在可见光的照射下，铱通过能量转移的方式催化附近的双吖丙啶探针生成卡宾自由基，卡宾自由基能够与邻近的氨基酸残基发生反应，从而实现结合口袋的邻位标记。值得一提的是，这种独特的μMap光催化临近标记法将靶向定位和邻近标记分配给不同的分子去完成，邻位标记不受限于靶向定位所需要满足的化学计量比的要求，可实现多个邻近位点的标记，具有信号放大的效果。此外，所有活性分子-铱光催化剂偶联物都可以配合使用统一的邻位标记探针，具有一致二级碎裂模式，有助于简化后续LC-MS数据分析。　　图1 μMap光催化邻近标记法原理　　为了确认该方法的选择性标记能力，作者以牛碳酸酐酶(CA)为例，探究磺胺类抑制剂-铱催化剂偶联物(图2A sulfonamide-Ir (1))能否触发CA上邻近结合位点的选择性标记。将CA与BSA蛋白按照1：1混合，向中加入sulfonamide-Ir，随后加入带有生物素标签的邻位标记探针(图2A Diazirine-PEG3-biotin(2))，根据Western blot的结果可知(图2B)，sulfonamide-Ir (1)的加入触发了CA上的选择性标记，相比于未开启光照以及直接加入free-Ir的两组样品，加入sulfonamide-Ir的样品中CA条带明显变深，说明此条件下，CA上有较多的带有生物素标签的标记位点。随后，作者对样品进行柱上酶切，利用LC-MS鉴定标记肽段、定位标记位点(图2C-E)。值得注意的是，为了获得高置信度的标记残基信息，作者将free-Ir设置为对照组，通过统计sulfonamide-Ir组与free-Ir组中同一标记肽段信号强度的倍差变化(fold change)以及显著性差异分析，筛选出最可靠的标记位点。此次实验结果显示，邻近标记位点为Q135和H2，将其映射至CA的晶体结构上可知两个位点距离磺胺类小分子与CA的结合位点分别17和11Å，说明μMap光催化临近标记法在小分子结合位点的鉴定上是准确且可靠的。　　图2 μMap光催化邻近标记法用于sulfonamide-CA结合位点的表征。为了展现μMap光催化临近标记法的普适性。作者将该方法应用到了其它一些蛋白-配体复合物模型上，如:(+)-JQ-1与BRD4(图3A)、dasatinib与BTK(图3B)、AT7519与CDK2(图3C)和lenalidomide与CRBN(图3D)，以上实验均获得符合预期的结果。此外，作者还将μMap光催化临近标记法应用到了分子胶rapamycin介导的FKBP12-rapamycin-mTOR蛋白复合物结合界面的表征，展现了该方法“穿越空间”的结构表征能力，从蛋白FKBP12与小分子rapamycin互作到小分子rapamycin与蛋白mTOR的互作，描绘了整个结合界面的轮廓(图3E)。　　图3 μMap光催化邻近标记法用于A)(+)-JQ-1与BRD4 B)dasatinib与BTK C)AT7519与CDK2 D)lenalidomide与CRBN E)FKBP12-rapamycin-mTOR蛋白复合物结合位点的鉴定。　　以上均是在已知结合位点的蛋白-配体模型中开展的方法学验证实验，后续作者还将μMap光催化临近标记法应用到难成药靶点STAT3。MM-206是STAT3的小分子抑制剂，在临床前疾病模型研究中显示出较好的抗STAT3活性，但到目前为止还没有STAT3与MM-206结合的晶体结构报道，也没有关于MM-206与STAT3结合位点的信息。在本文中，μMap光催化临近标记的结果显示MM-206主要是结合在STAT3的CCD结构域上，大致在Q198和V291位点附近，属于一种变构调节剂(图4A-B)。最后，作者进一步探究了μMap光催化临近标记法在活细胞水平上的标记能力。如图C-E,使用μMap光催化临近标记法成功找到了(+)-JQ-1的结合蛋白：BRD2、BRD3及BRD4，并定位到了(+)-JQ-1与BRD4结合位点，大致在V90、K91、W81氨基酸残基附近。　　图4 μMap光催化邻近标记法用于A-B)MM-206与难成药靶点STAT3结合位点的鉴定 C-E)组学样品中小分子(+)-JQ-1结合蛋白的鉴定及结合位点的锁定。　　总之，本文开发了一种通过标记近端残基来绘制小分子结合位点的通用方法。该方法已被证明适用于一系列小分子配体-蛋白质、多蛋白质复合物和“不可成药”的靶点蛋白的互作表征，从单一蛋白到组学层面均展现出良好的应用前景。　　撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：μMap Photoproximity Labeling Enables Small Molecule Binding Site Mapping　　参考文献　　Huth SW, Oakley JV, Seath CP, et al. μMap Photoproximity Labeling Enables Small Molecule Binding Site Mapping. J Am Chem Soc. 2023 145(30):16289-16296.

手机控也沉默的第一天 　　展览第一天，宾客如潮。(管它人多人少，小编就这样固执的认为了!)少年们忙着迎接莅临展台的领导、客户、新老朋友，一定是忙得不可开交。把&ldquo 不可开交&rdquo 四个字落在纸上容易，但怎么给各位看官解释明白呢? 　　小编一通挠头发拍大腿之后，(小刚导演说这样的模仿不好，so 偶不演，不演哈~)想到了这个：&ldquo 整整一个白天，现场的同事没发来一张照片，微信木有更新任何状态，连平时几乎要7*24的手机控小哥也惊人的，沉(默)了!&rdquo &mdash &mdash 现在各位看官知道会场有多忙了吧，忙到今儿的贵宾照也只能等小编回头再给您补了&hellip &hellip 　　CACA，华人的聚会 　　开展会的时候当然是忙疯了，但工作结束之后呢?恨不得天天走南闯北，四处飘(chu)荡(chai)的看官们，您们身在异乡的那些个夜晚吖，都是怎样的煎(huan)熬(le)呢?是逛街吃饭，感受风土人情?是跟客户/同事推杯换盏，联络深厚感情?还是早早钻进被窝里，刷手机，看电视，抓紧时间享受媳妇/女友不在身边时一个人的好(ji)心(mo)情(a)? 　　爆料!爆料!看看咱们的大人物Dr.Chen下班后的样子。。。看!看!就在这里哦! 北美华人色谱协会(Chinese American Chromatography Association ，CACA)聚会现场 　　Dr. Richard Henry 主席正在跟大家分享&ldquo Should Elevated Temperature Become More Useful or Less Useful for Modern hplc?&rdquo 　　没有找到Dr.Chen吧?失望了吧?那就对了。因为。。。照片是他拍的@-@~(小编不是shua您，表生气哈。怪就怪另外的两个少年云游去了，偶就这样不负责任的xia说了，谁让他们没给陈博士照相呢，让您失望了，回来俺说Ta哈~) 　　扯远了，拉回来。(=.=~)咱还是聊聊CACA吧。这个中西结合的&ldquo 北美华人色谱协会(Chinese American Chromatography Association，CACA)&rdquo 。CACA小盆友成立于2008年5月12日，是一个非营利组织，由在北美从事色谱相关领域研究的杰出科学家和在色谱领域创业的企业家组成。博纳艾杰尔总经理汪群杰博士也是创始人之一哦。由于协会会员居住地比较分散，因此选择在HPLC和Pittcon会议同期举办CACA的联谊会。迄今为止这样的聚会已经举办了8年。听说今年有100多位专家学者到场参会!大部分都是药厂的分析科学家!(&ldquo 人来的不少，我很欣慰~o(&cap _&cap )o 哈哈~&rdquo ) 　　CACA主席Tao Jiang博士在开始之初为大家介绍了协会的发展历程。真是太遗憾了，没能现场聆听这个传奇故事，小编从caca网站上扒下来了这段主席致辞，帮跟俺一样好奇的看官们复习下&ldquo 听说读 xie&rdquo 哈 　　致辞来了，英语不好的童鞋们要挺住吖~~~ 　　Message from the President 　　Dear Friends, 　　Welcome to the Chinese American Chromatography Association (CACA)! 　　CACA was formed on May 12, 2008 during the HPLC&rsquo 2008 conference in Baltimore, Maryland, USA. We are a non-profit organization and our missions are (1) sharing technical information in the area of separation sciences, particularly in the area of chromatography, within the United States and around the world (2) providing a network for members to share experiences and help each other in career development and (3) providing a forum for interacting and developing cooperative relationships with other separation organizations, particularly in mainland China, Taiwan, and Hong Kong. 　　Under the leadership of our former presidents, Dr. Yan-Bo Yang and Dr. Michael Ye, CACA has grown significantly in the past years. We have now more than 300 members from academia, government and industry. We have also established good relationship with other organizations, such as CASSS, MACC, LCGC and SepuNet. During the past years, CACA has successfully organized workshops and dinner events at Pittcon and HPLC conferences with many invited speakers from academia, government, and industry to give highly inspired speeches. We also have had many sponsors from industry, which made it possible financially to organize the events and provide assistance to students at these events. Please visit our website at www.ca-ca.org and LinkedIn group at http://www.linkedin.com/groups?mostPopular=&gid=1857030 for more information. 　　While members of the Association are mainly Chinese American and Chinese scientists working in the US, all separation scientists from other nationalities and other parts of the world are also welcome to join. The membership is on a voluntary basis and free of charge. 　　I hope to see you at one of CACA organized events in the near future. Please pass the information about CACA along to your friends and co-workers. 　　Good luck to you and CACA. 　　Tao Jiang, Ph.D. 　　President, CACA 　　您还没尽兴?得嘞~咱再贴张今儿的聚会日程。现场情景?!各位看官，尽情脑补去吧~ 　　Tao Jiang原来是位女侠啊 　　据悉，这位Tao Jiang博士师从关亚风老师哦!关亚风老师跟博纳艾杰尔可是老相识啦! 　　想想俺也算认识关老师了(有点儿大(da)言(yan)不(bu)惭(chan)哈~)，可这Tao Jiang博士真是第一回见。看合影才知道，竟然是位女侠!偶对您的敬仰真是犹如滔滔江水，绵延不绝&hellip &hellip Tao Jiang博士(左二)与博纳艾杰尔Dr.Chen团队合影 　　【为(mi)数(zu)不(zhen)多(gui)的现场合影】 　　美国时间临睡前，微信上出现了这样两张照片。真的不是只来了两个人，是少年们实在困了，累了，要睡了。。。好好睡吧，辛苦的人们!睡醒了新的一天就要来啦~~~ 　　======================隔天又来捣乱的&ldquo 分割线君&rdquo ! 　　帅哥戏狗，有图为证!xiong哥，你这么调皮，你家儿子知道吗 　　。。。 　　微信证明，偶是替你许过愿的：祝你顺利吃上米国2斤+的大龙虾，入口前记得上图啊!空盘的就别发了~~ 　　各位看官，咱不说今儿就到这儿了，因为我们懂得，您明儿还会来! 明儿见了，您呐!