苄胺邻

工业微生物常用于重要的生物和化学制品的生产，优良菌株的选育是生物产业的核心工作之一。近年来合成生物技术的快速发展使得高性能工业菌株基因型的理性构建性显著增加，但如何从海量候选菌株库中高通量筛选到规模生产用的工业菌株仍面临挑战。多孔板（MTP）筛选系统和流式细胞术（FACS）是研究者常用的筛选手段，但MTP通量较低，而FACS难以用于检测胞外分泌的代谢物。液滴微流控技术在微生物育种领域的应用，成功实现了大容量突变库的全面评价以及高效筛选，不仅在筛选通量方面实现了大幅度提升，有效提高了菌株选育工作效率，而且在筛选成本方面也展现出巨大优势，可显著降低筛选过程中试剂耗材的用量，将单克隆的筛选成本降低至十分之一或百分之一，实现高通量、低消耗的优良工业菌株选育。天木生物基于液滴微流控技术开发了皮升级单细胞分选平台--DREM cell（Droplet entrapping microfluidic cell-sorter）具有体积小、通量高、体系封闭、无交叉污染等特点，越来越成为科学研究和企业生产的重要技术手段。近日，清华大学张翀、安徽工程大学薛正莲研究团队应用DREM cell将液滴微流控技术与基因编码荧光生物传感器相结合，成功实现了高产谷氨酰胺酶突变株的超高通量筛选，相关研究成果以“Combining genetically encoded biosensors with droplet microfluidic system for enhanced glutaminase production by Bacillus amyloliquefaciens”为题，发表在生物化工领域专业期刊《Biochemical Engineering Journal》上。研究团队开发了一种利用谷氨酸拟荧光蛋白传感器 iGluSnFR 的谷氨酰胺酶荧光检测方法，相较于传统的高效液相色谱法，速度提高了700倍。基于iGlusnFR传感器，结合DREM cell单细胞分选平台实现谷氨酰胺酶生产菌株的高通量筛选，单次实验可筛选10万克隆，效率远远超过传统孔板筛选技术。最终项目团队对常压室温等离子体（ARTP）诱变的解淀粉芽孢杆菌全基因组突变文库进行超高通量筛选，成功获得了一株谷氨酰胺酶产量提高47%以上的突变株。该筛选平台，与微孔板筛选系统相比，筛选率提高500倍，试剂用量减少2万倍，并且可以节省大量的多孔板、培养皿、枪头等耗材。▲图丨液滴微流控高通量筛选平台流程图背景信息研究团队所使用的液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）是天木生物基于液滴微流控技术开发的皮升级液滴微流控单细胞分选平台，可将待筛选细胞进行包被形成单细胞微液滴，结合荧光筛选模型，可以在细胞水平完成微生物的高通量分离、培养、检测、分选等。▲图丨液滴微流控细胞分选仪（来源：天木生物）高通量皮升级液滴单细胞分选系统（DREM cell）相比于传统筛选方法，筛选效率可提升1万倍，试剂消耗量可下降至百万分之一，在筛选通量显著提升的同时，单克隆筛选成本大幅度降低。该仪器不仅可广泛应用于细菌、酵母、动物细胞等的高通量筛选，还可以应用于蛋白、核酸、抗体等生物大分子筛选等相关研究领域。项目技术参数液滴体积1-1000pL荧光激发与检测可选波段：（1）激发波长488nm，检测波长525±15nm，灵敏度1μM荧光素/单液滴（2）激发波长532nm，检测波长578±11nm，灵敏度100nM试卤灵/单液滴液滴生产频率0-10000个/s液滴分选频率0-1000个/s微注入速度0-1000个/s样品低温控制系统4℃恒温控制，±0.5℃工作环境常压状态下，室温，30%≤湿度≤80%，洁净暗室整机功率600W应用范围细胞、酵母、细菌、蛋白、核酸等

本文由农业农村部环境保护科研监测所课题组所作，通讯作者为耿岳博士，文章发表于Journal of Separation Science（J Sep Sci. 2022,1– 12, https://doi.org/10.1002/jssc.202200006）。 Part 01 研究背景 乙酰甲胺磷是一种广谱有机磷杀虫剂，在作物中可通过酰胺水解转化为毒性更大的代谢物甲胺磷。乙酰甲胺磷和甲胺磷均由一对对映体组成，虽然不同对映体的理化性质相同，但在活性、毒性和降解行为方面存在显著差异。因此，开发高效的乙酰甲胺磷及其代谢物甲胺磷对映体的分离和测定方法，并开展对映体选择性研究对乙酰甲胺磷及其代谢物的评估具有重要意义。目前手性分离主要采用手性色谱柱结合HPLC、GC、GC-MS/MS和LC-MS/MS进行，但对于部分手性农药存在分析时间长、分离度差等问题。 SFC-MS/MS因具有分析时间短、分离度高、有机溶剂消耗低等优点，已广泛应用于手性农药对映体的分析。本研究建立了一种绿色、灵敏、高效的SFC- MS/MS检测普通白菜中乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体残留的方法。为了验证所建立的方法，在中国北方温室条件下，通过盆栽试验研究了乙酰甲胺磷及其代谢产物甲胺磷在普通白菜中的残留情况。此研究系利用SFC - MS/MS对蔬菜样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体的选择性进行报道，为手性杀虫剂乙酰甲胺磷的科学评价提供了基础资料。 Part 02 研究结果 1、对映体拆分方法的优化采用Nexera UC SFC-MS/MS系统，经过手性固定相、流动相、有机改性剂种类及比例、背压和柱温的优化等，确定最终的仪器条件。 1）色谱条件色谱柱：Chiralcel OD-H column (250 × 4.6 mm, 5 μm) ；流动相：A (CO2)/B乙醇= 95/ 5，v /v；流速：3 mL /min；柱温：40℃；背压：10 MPa；补偿溶剂 (0.1% 甲酸甲醇溶液) 流速：0.1 mL/min； 2）质谱条件离子源参数：雾化气流速：3 L/min (N2, 99.5%)；加热气流速：10 L /min(干燥空气)；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气体流速：10 L/min (N2, 99.5%)。 质谱参数：按上述条件，不同对映体出峰时间为：R-乙酰甲胺磷(4.20 min)、S-乙酰甲胺磷(4.91 min)、R-甲胺磷(5.97 min)、S-甲胺磷(6.68 min) 。不同条件下的对映体拆分结果见（图1）。图1 SFC-MS/MS上乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体的色谱图、分离度和保留时间 2、方法学考察 对建立的对映体分析方法进行系统的方法学考察，包括线性、回收率、精密度、定量限等。不同对映体在溶剂和基质标准中均有良好的线性(具体见表1)。通过比较溶剂标和基质标进行基质效应评价，乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体在普通白菜基质中表现出较强的基质抑制效应，为了消除基质效应，本研究采用基质匹配标准溶液进行定量。乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体的定量限均为0.005 mg/kg。在3个添加水平(0.01、0.1和1 mg/kg)下对普通白菜空白样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷进行回收率试验，评价方法的准确性和精密度。化合物在普通白菜中的日内平均回收率(RSDs)为70.4−98.5% (1.4−10.9%)，日间平均回收率(RSDs)为75.4−87.5% (6.1−13.4%)。结果表明，所建立的方法精密度和重现性良好，可满足普通白菜中乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体的测定要求。 表1 不同对映体的线性、相关系数和基质效应图2 R-乙酰甲胺磷、S-乙酰甲胺磷和Rac-乙酰甲胺磷(外消旋乙酰甲胺磷)及其代谢产物R-甲胺磷、S-甲胺磷和Rac-甲胺磷的残留量 图3 R-乙酰甲胺磷(A)、S-乙酰甲胺磷(B)、Rac-乙酰甲胺磷(C)及其代谢产物R-甲胺磷(D)、S-甲胺磷(E)、Rac-甲胺磷(F)（外消旋甲胺磷）在普通白菜中的消解曲线 3、方法应用 为验证SFC-MS/MS分析方法的有效性，对普通白菜样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷的对映体进行了分析。结果表明，乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体在普通白菜中的降解均符合一级动力学方程，R2在0.944 ~ 0.992之间(图3)，半衰期分别为：4.39 (R-乙酰甲胺磷)、2.91 (S-乙酰甲胺磷)、3.9(Rac-乙酰甲胺磷)天、10.91（R-甲胺磷）、6.24（S-甲胺磷）和9.10（Rac-甲胺磷）天。R-乙酰甲胺磷的半衰期是S-乙酰甲胺磷的1.51倍，表明其降解具有对映体选择性；在普通白菜中甲胺磷半衰期比乙酰甲胺磷长，表明甲胺磷比其母体具有更强的持久性。 Part 03 结论 基于岛津Nexara UC系统，建立了一种快速、简便、灵敏的测定普通白菜中乙酰甲胺磷及其高毒代谢物甲胺磷对映体的分析方法，本方法可在8分钟内实现手性对映体的基线分离，每针样品仅消耗1.2 mL有机溶剂（乙醇）。同时进一步应用该方法评价了乙酰甲胺磷及其代谢产物对映体在普通白菜中的手性选择性消解规律研究。本方法具有良好的精密度和重现性，满足普通白菜样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体残留测定的要求。 关联仪器Nexera UC 所提供的解决方案• 临界流体的低粘度以实现快速分离• 提高峰容量与分离度• 利用高渗透性，对异构体或手性化合物实现快速分离• 差异化的分离模式提高灵敏度• 无分流样品导入技术提升灵敏度• 减少有机溶剂消耗，在降低成本的同时降低对环境的影响 文献题目《Enantioseparation and dissipation of acephate and its highly toxic metabolite methamidophos in pakchoi by supercritical fluid chromatography tandem mass spectrometry》 使用仪器岛津Nexera UC 作者Linjie Jiang1,2,3 Yue Geng1,2,3 LuWang1,2,3 Yi Peng1,2,3 Wei Jing4 Yaping Xu1,2,3 Xiaowei Liu1,2,31 Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Tianjin, P. R. China2 Key Laboratory for Environmental Factors Control of Agro-product Quality Safety, Ministry of Agriculture and RuralAffairs, Tianjin, P. R. China3 National Reference Laboratory for Agricultural Testing, Tianjin, P. R. China4 Shimadzu (China) Co., LTD. Beijing Branch, Beijing, P. R. China 声明 1、本文不提供文献原文。2、所引用文献仅供读者研究和学习参考，不得用于其他营利性活动。3、本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

在甘肃和青海发现问题奶粉前几天，吉林省也查出三聚氰胺含量严重超标奶粉，为此吉林省采取了紧急行动。 　　记者7月8日从吉林省工商等部门了解到，吉林市6月22日发现的“三聚氰胺超标奶粉”的样本正在进一步检测中，结果尚未出炉。 　　6月22日，吉林市工商局丰满分局在检查中，检测到辖区内一家市场零售点销售的黑龙江省大庆市一家乳品有限公司生产的一袋奶粉三聚氰胺含量严重超标，复检结果与第一次检测结果相同。 　　吉林市公安和工商部门迅速展开行动，将1000多袋问题奶粉进行了封存。随后，吉林省对这家企业生产的奶粉进行清查和追缴，并对封存产品进行了抽检。 　　目前，吉林省各有关部门对吉林市“三聚氰胺超标奶粉”事件正在展开全面调查，已将这家企业生产的所有产品在全省勒令下架封存。待事件调查清楚后，将由食品安全委员会统一发布相关情况。此外，吉林省质量技术监督局也于8日要求，从9日开始，在全省范围内开展对乳制品生产企业的检查。 　　青海、甘肃、吉林等省发现三聚氰胺超标奶粉后，有关部门要求严肃查处，杜绝问题奶粉流入市场，彻底查清其来源与销路，坚决予以销毁，并依法追究当事人责任。