质谱肿瘤检测

质谱技术作为重要的生命科学分析工具，在灵敏性、特异性、准确度、检测速度、检测通量等方面独具优势。目前基于LC-MS平台的靶向质谱方法已在临床检验中得到应用，基于非靶向质谱技术的创新应用也已初露锋芒。汇健科技基于激光解吸离子化质谱平台，融合了纳米材料、质谱技术、人工智能等多种技术，形成了仪器+试剂+软件+算法模型的完整非靶向质谱检测系统。所构筑的高技术壁垒质谱平台，以其高通量、高稳定性、高准确性、易操作及低成本的优势，为肿瘤早筛及精准诊断提供新的解决方案。本文摘录了汇健科技创始人邬建敏的采访内容，深入了解汇健科技提供的肿瘤早筛创新的解决方案。　　“3T”构建肿瘤早筛创新技术平台，让“一平台，多组学联检”成为可能　　质谱技术可输出丰富的分子定性及定量信息，因而在临床检测领域正扮演着越来越重要的角色。近年来，临床质谱检测已经逐渐成为一颗极富潜力的新星，有望成为IVD领域的下一个爆发点。　　基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，该质谱技术能对生物样本中的蛋白、多肽、核酸、代谢小分子等的进行分析。由于其分析速度快、通量高，操作简便等特点，MALDI-TOF质谱是现阶段最有希望大规模走进医院检验科开展临床诊断和筛查的质谱技术。　　自21世纪以来，国际学术界及科技创新公司一直在探索MALDI-TOF质谱技术在临床诊断领域的应用潜能。例如，美国Bruker公司率先在MALDI-TOF质谱平台建立了微生物质谱数据库，并获得了FDA医疗器械注册证。随后全球多家IVD公司涉足了微生物质谱领域，极大地推动了质谱技术的临床应用。　　Agena(原Sequenom Bioscience)公司建立了核酸质谱分析平台，开展SNP分型检测业务，但更多地在LDT服务领域应用。在肿瘤诊断领域，国际上也有少数公司曾基于MALDI-TOF质谱平台开展肿瘤诊断产品的开发。比如，澳大利亚的HealthLinx公司曾利用该质谱平台开发卵巢癌诊断试剂和诊断方法。美国Biodesix公司曾开发了一款基于蛋白谱分析的诊断产品，用于非小细胞肺癌患者的用药指导和预后判断的产品。　　我国近年来加大了质谱在精准医疗应用的政策支持力度。国家科技部2017年设立了“精准医学临床质谱专项”，大力推动质谱在精准医疗领域的应用。一些大型第三方医学检验实验室利用相对成熟的LC-MS靶向质谱平台开展临床检验服务，如新生儿遗传代谢物，药物浓度，激素浓度，维生素浓度等检测。基于MALDI-TOF平台，国内一些成熟的上市公司获得或正在报批微生物及核酸质谱的NMPA医疗器械注册证，如安图生物、华大基因等。难能可贵的是，最近几年国内涌现了一批致力于质谱仪器、临床质谱新技术及新产品研发的创新型公司。上述公司在质谱产业链中各有侧重，自主研发质谱仪器、质谱方法学、质谱试剂及耗材、质谱数据分析及诊断解读软件等。　　汇健科技采用了国际领先的颗粒原位MALDI-TOF MS分析技术(On-particle Detection-MS，简称OPD-MS)及芯片原位检测技术(On-chip Detection-MS，简称OCD-MS)，大大简化了临床样本预处理和检测过程，为多肽、代谢、基因等多组学标志物的发现和检测提供高效的技术手段。　　　　基于“3T” 技术的全新一代肿瘤精准诊断及筛查平台　　汇健科技的质谱技术平台由“3T”组成——BT(Biotechnology 生物学技术)、MT(Materials Technology 材料学技术)、IT(Information Technology信息学技术)，邬建敏详细讲述了采用“3T”技术搭建肿瘤早筛平台的过程。　　汇健科技研发人员前期做了大量的文献检索及生物信息学相关的基础研究(比如组学代谢通路及信号通路的研究等)，并参考了大量中外文献，发现血清中的内源性多肽、尿液以及唾液中的多肽及代谢物与疾病，尤其是与肿瘤具有极强的相关性。这为探索肽谱及代谢谱在肿瘤等疾病筛查、诊断、分型等的临床应用奠定了生物学基础。　　然而血清中的内源性多肽在血清中丰度低、易降解、受高丰度蛋白干扰大，因而血清内源性多肽质谱检测的稳定性和重现性难以实现，限制了肿瘤肽谱的临床应用。为满足体外诊断的检测质量要求，实现肿瘤肽谱在临床诊断中真正应用，汇健科技运用半导体材料原理，开发了Bio-pSi® 纳米材料显著提升了捕获、富集、保护内源性多肽的效果，使得多批次大量样本检测的重现性和准确度有了质的飞跃。目前，汇健科技对血清多肽质谱检测的CV控制水准达到领先水平。　　此外，汇健科技针对代谢物在MALDI-TOF平台检测易受传统有机基质背景干扰、信号强度低、代谢物种类覆盖率低等问题，开发了一些列纳米质谱芯片和耗材，实现了血清、唾液、尿液、细胞、组织等多元样本中的小分子代谢物及脂质代谢物高通量检测，极大地扩展了激光解析离子化质谱技术的应用领域。同时，汇健科技还开发了微生物质谱芯片和核酸质谱芯片，性能达到国际对标产品的水准。上述质谱芯片系列产品让“一平台，多联检”成为可能，并有望扩展MALDI-TOF质谱的临床应用场景。上述材料技术(MT)的创新使汇健科技具备了核心差异化优势。　　由于非靶向质谱技术数据量庞大，标志物的发现、寻找、确认及诊断模型的建立均需经过大数据分析及AI算法建立模型。因此，汇健科技的生信研发团队在质谱信息的数据挖掘方面具有深厚的积累，建立了一批用于质谱数据评价、分析、数据库构建、建模和判别等软件，获得了一批临床质谱软件著作权，并构建了云数据库。汇健IT技术的赋能使得MALDI-TOF质谱具备了数据学习和智能诊断的能力。　ClinMS-Plat® I 肿瘤肽谱检测应用系统，筑起技术高壁垒　　基于先进的半导体纳米技术和人工智能算法，汇健科技的科学家团队建立了高通量临床质谱及人工嗅觉传感系统两大技术平台，依托上述平台型技术获取多元样本、多组学、多维质谱数据库，解决临床质谱产业化瓶颈，开发了国内首套ClinMS-Plat I 肿瘤肽谱检测应用系统。这套应用系统集ClinMS-Plat I 全自动多肽分析质谱仪、Bio-pSi® 血清肽谱检测试剂盒和 HJ Cloud™ 分析软件为一体，形成“试剂+仪器+软件(AI算法)+数据+服务”的闭环产业模式，拥有专利、软著、商标等自主知识产权四十余项，构成技术与商业模式双壁垒。　　　　汇健科技聚焦高通量多肽组和代谢组学，通过对多元样本的双组学分析，构筑肿瘤质谱数据库，并通过AI算法建立和优化诊断模型，实现对多种肿瘤的高敏感性和高特异性的辅助诊断，可以广泛应用于疾病筛查及监测、精准诊断、预后判断、用药指导和疗效监测等多个临床环节，有望成为下一代无创诊断的液体活检平台。　　邬建敏说，汇健科技ClinMS-Plat I 肿瘤肽谱检测系统仅需微升级别血清样本，操作简便、每批血清样本通常可在半个工作日内即可出检验报告，同时，产品稳定性及重复性好，诊断正确率远高于现有的肿瘤标志物，检测价格显著低于同类液体活检产品。血清样本更容易被医院的检验科接受，而且患者的依从性比较好。另外，汇健科技这套ClinMS-Plat I 肿瘤肽谱检测系统还可拓展至肺癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等多癌种的筛查。初步数据显示多种瘤种的诊断准确性超过或接近90%。目前，公司研发人员正在开展大规模临床样本测试，已经证明了基于肿瘤肽谱的液体活检技术兼顾了敏感性和特异性，优势明显，是比较理想的全新一代液体活检技术。　　启动常津采-LungScr项目， 推动肿瘤筛查　　为推动肺癌肿瘤早筛，2021年3月，汇健科技旗下的杭州汇健智谱医学检验实验室有限公司发起了常津采-LungScr真实世界研究项目，国内多家知名三甲医院共同参与进行回顾性及前瞻性临床研究。该项目致力于利用唾液无创诊断技术提供院外肺癌筛查和肺结节管理，辅助医生进行患者管理、减少诊疗压力。公司利用OCD-MS平台，仅需少量唾液就能采集到丰富的人体代谢组信息，并通过机器学习等算法挖掘与疾病关联的代谢标志物。　　　　常津采-LungScr项目招募10000名志愿者，涵盖了健康人群、肺结节等肺部良性疾病患者、肺癌患者。通过线上与线下收样模式对志愿者唾液进行代谢组检测，构建基于唾液代谢组的肺结节管理模型，可在完全无创的情况下快速区分早期肺癌患者与健康志愿者，进而实现肺部健康评估。　　邬建敏说，汇健科技目前组建了超过8家多中心的临床研究团队，常津采-LungScr™ 项目分为四个阶段开展工作，包括流程验证、检测模型的稳定性验证、准确性验证、规模化服务等环节。研究团队利用汇健科技自主研发的唾液代谢组高通量质谱平台，已经检测数百例临床唾液样本，在唾液中发现了多种与肺癌相关的特异性标志物，对早期肺癌的检测敏感性达90%以上。同时，公司也正在进行前期的市场教育、宣传的工作，让基于硬科技的健康管理模式被更多的医疗机构、社区、个人所接受。　　邬建敏表示，常津采项目是系列项目，除了目前正在进行的常津采-LungScr项目，之后也会开展更多的子项目，包括常津采胃癌项目等。　　肿瘤肽谱与多组学联检相结合，建立肿瘤全流程管理系统　　肿瘤到癌变是非常复杂的生物学过程，从系统生物学来看，肿瘤的发生可能会在基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等多个组学层面发生一系列的变化，用单一指标可能很难真正判断出肿瘤的状态，多标志物及多组学联检可以进一步提升筛查及诊断的敏感性和特异性。汇健科技聚焦在多肽组学及代谢组学开展多元样本(血液、尿液、唾液、细胞、组织等)的多指标肿瘤联合检测。未来，汇健科技也将与更多不同组学的公司展开合作，为医生及患者提供更丰富的多组学疾病信息，推动癌症早筛技术的发展。　　多组学诊断技术除了可用于肿瘤筛查与诊断之外，还可以对同一种肿瘤进行分型。许多恶性肿瘤有多个不同的亚型，不同的肿瘤亚型的用药方案、治疗方案都不一样。另外，还可以通过多组学技术监测肿瘤的复发、转移等。邬建敏说：“多组学联检的应用场景更加广泛，肯定是未来早筛及精准医学的一个方向。”　　基于多组学技术的肿瘤早筛仍处于萌芽阶段，其发展有很大的空间。邬建敏表示，组学诊断技术的发展并不会阻碍现有的血清肿瘤标志物在临床检验中的应用。我们在对肠癌诊断的数据表明，血清多肽组学与传统的血清肿瘤标志物相结合，可以进一步提高诊断的准确性、敏感性、特异性。　　未来，汇健科技将通过两方面推动质谱技术在肿瘤早筛及精准诊断中的应用，一是把组学标志物与传统肿瘤标志物进行联检。目前，汇健科技拟与大型IVD企业合作，推动组学技术与传统肿标技术的联合运用 二是通过组学技术的数据挖掘开发肿瘤全流程管理的联合应用场景，覆盖筛查、诊断、分型、愈后、疗效监测、复发转移监测等。邬建敏说，目前大型医院的肿瘤内科和肿瘤外科都希望建立一整套肿瘤全流程管理系统，汇健科技将以肿瘤肽谱和代谢谱作为新一代液体活检产品的发力点，可以满足这样的临床需求。　　汇健科技将纳米材料技术、质谱技术和人工智能技术相结合，构筑具备临床价值和产业化价值的体外诊断产品和服务管线。未来，汇健科技将基于自主研发的组学诊断产品和服务，撬动临床质谱在肿瘤早筛的应用市场。　　关于汇健科技　　杭州汇健科技有限公司是一家由科学家和企业家联合创建的高科技公司，企业的宗旨是服务于人类健康、生活质量和生命安全。公司坚持以技术创新为核心，以感知-汇知-智慧为理念，服务全球医疗健康产业。基于自主研发的新型纳米芯片和微纳颗粒可实现体液和组织样本的高通量高灵敏质谱数据采集，结合深度学习和机器学习等AI技术以及即将推出的ClinMS-Plat I 临床质谱系统，将构成新一代的液体和组织活检平台。相比于传统的体外诊断和组织活检工具，该平台将提供更为丰富和准确的诊断信息，未来将应用于疾病筛查、精准诊断、用药指导、药物反应监测和手术指导等医学领域。

肝胆胰恶性肿瘤起病隐匿，导致诊断、治疗延后，影响预后。目前临床使用的血清学标志物灵敏度及特异度仍有待提升。在过去的十年中，免疫治疗的发展改变了癌症的治疗现状。一项使用小鼠模型的研究发现肿瘤可诱导系统免疫功能障碍，且这一障碍可通过肿瘤切除得到逆转。越来越多的证据也提示肿瘤发生发展伴随着系统性免疫紊乱和外周免疫细胞的改变。因此，探测外周血免疫细胞组成变化可能有助于早期发现肝胆胰恶性肿瘤。质谱流式技术(CyTOF)作为新发展起来的检测免疫细胞组成和数量的技术，可获得外周血免疫细胞组成、表型和功能的高维信息。利用质谱流式技术评价外周免疫状态，有望为肿瘤早筛早诊提供全新工具。　　　　近日，浙江大学医学院附属第一医院梁廷波教授团队联合国内14家医院在Gut上在线发表了题为Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: a multicentre study的研究成果。该研究基于质谱流式检测外周血细胞组分改变构建了肝癌、胰腺癌筛查模型，取得了优异的肿瘤诊断效能，有望提高相关肿瘤早诊率，进而改善这部分患者的预后情况。　　　　这是一项前瞻性、多中心临床研究，共入组2348名受试者，其中包含肝癌患者790名，肝良性疾病患者341名，胰腺癌患者376名，胰腺良性疾病患者208名，健康受试者633名。采集受试者外周血并进行质谱流式分析，通过来自浙大一院的训练集及随机森林算法完成模型构建，并在内部验证队列和10余家外部验证队列中进行模型效能评价。研究者建立了外周免疫评分PBIScore和联合现有临床肿瘤标志物的整合外周免疫评分iPBIScore。阿里云提供了云计算服务。　　结果显示，基于PBIScore的肝癌诊断模型在训练集、内部验证集、外部验证集的AUC分别达到0.98、0.91、0.85 基于iPBScore的肝癌诊断筛查在训练集、内部验证集、外部验证集点AUC分别达到0.99、0.97、0.96。基于PBIScore的胰腺癌诊断模型在训练集、内部验证集、外部验证集的AUC分别达到0.98、0.89、0.89 基于iPBScore的胰腺癌诊断筛查在训练集、内部验证集、外部验证集点AUC分别达到0.99、0.98、0.97。同时，在肿瘤标志物阴性和极早期肝癌、胰腺癌患者中该模型也保持了很好的检测效能。　　此研究是目前最大规模的基于质谱流式技术评估外周免疫并开发肿瘤诊断方法的研究，在取得优异诊断性能的同时提示，进一步明确了外周免疫细胞亚群的改变可以反映肿瘤发生发展情况。值得一提的是，该研究显示，这一方法有作为泛癌早筛早诊的潜能，将可能在未来健康人体检和肿瘤高危人群筛查中发挥重要作用。　　原文链接：　　https://gut.bmj.com/content/early/2022/09/15/gutjnl-2022-327496

p style=" text-align: justify " 　　肿瘤具有高死亡率、高转移率和高复发率，是危害人类健康的重大疾病。诊断肿瘤的传统方法有病理组织活检、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、电子计算机断层扫描(computed tomography，CT)、B超、X线胸片、内镜检查等。这些检查对于肿瘤早期的检测效果十分有限，部分检测方法不仅价格昂贵，且会给患者带来痛苦。因此，在肿瘤早期阶段开展快速、有效的检测十分必要，不仅可以达到早发现、早治疗的目的，还可以改善患者就医体验。肿瘤标志物的筛检对于肿瘤早期检测具有重要意义[1]。 /p p style=" text-align: justify " 　　肿瘤标志物是指由肿瘤组织或宿主与肿瘤相互作用所产生的一类活性物质，能够提示肿瘤存在与生长变化。肿瘤标志物常常存在于血清、细胞、尿液、体液或组织中，常见的有癌胚蛋白、肿瘤抗原、酶类标志物、激素、糖类抗原等。肿瘤标志物检测具有操作便捷、标本易获取、非侵入性、价格低廉、易于动态监测疾病等优点。肿瘤标志物的检测对于肿瘤的预防、早期诊断与鉴别诊断、辅助肿瘤分类、疾病监测、指导治疗和预后判断有重要作用，可有效弥补其他医学技术对肿瘤诊断、治疗及预后判断的不足[2]。肿瘤标志物种类繁多，检测方法也各异，本文将几种常见肿瘤标志物检测方法的研究进展作一综述。 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 1、放射免疫分析 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　放射免疫分析是一种传统的检测肿瘤标志物的方法，是将放射性核素检测技术与抗原抗体结合特异性的特点相结合，以定量微量物质。放射免疫分析多使用放射性核素125I，因其具有放射性高、易标记、衰变过程中释放的射线易于被检测等优势，逐渐替代了3H和14C而被广泛使用。放射性核素标记具有高灵敏度、易于商品化等优势，曾被广泛应用，但与其他方法[3]相比，存在试剂盒使用寿命短、有放射性污染风险等缺点，目前已逐渐被其他检测方法取代。 /p p style=" text-align: justify " 　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 　2、化学发光免疫分析 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　化学发光免疫分析是目前常用和较为成熟的肿瘤标志物检测技术，其利用化学发光物质作为标记物，根据发光信号的强度来判断待测物质的量。自1928年德国化学家Albrecht发现鲁米诺的化学发光特性后，该检测技术由于灵敏度高、快速、线性范围广、仪器结构简单、适合小型化、无放射性危害等优点得到不断发展[4，5]。化学发光免疫分析为化学发光法，使用直接发光物质(如吖啶酯)标记抗体，或使用酶类催化剂(如辣根过氧化物酶)[6]标记抗原抗体。将化学发光技术与微芯片电泳化学发光(microchip-electrophoresis chemiluminescence，MCE-CL)等技术联合使用，具有效率高、分析快、自动化程度高、需要更少样品和试剂的优点[7，8]。 /p p style=" text-align: justify " 　　传统化学免疫分析采用酶标技术，用辣根过氧化物酶催化鲁米诺的免疫测定技术曾被广泛使用，目前的免疫测定系统通常使用信号探针标记抗体并进一步测量目标分析物浓度。但这类天然酶具有稳定性差、来源有限、对环境变化敏感、易受环境影响而变性等缺点，且标记过程通常会损害抗体分子的生物活性，因而基于金属及金属复合物[9，10]、磁性纳米颗粒[11]、量子点[12]等催化发光底物的无酶免疫系统[13]不断发展，将电化学技术和化学发光相结合检测肿瘤标志物，兼具了化学发光的高灵敏度和电化学的时间、空间可控性[14，15]的优点。有研究人员以CuS纳米粒子作为过氧化物酶模拟物，设计了一种新型的无标记化学发光(chemiluminescence，CL)免疫方法测定甲胎蛋白，与基于酶标的CL免疫测定法相比，提出的无标记测定模式更简单、价廉、快速。采用无标记的CL免疫测定法测定甲胎蛋白的线性范围为0.1~60ng/mL，检出限为0.07 ng/mL，且此CL免疫测定系统显示出良好的特异性、可接受的重复性和良好的准确性[16]。 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 3、酶联免疫吸附试验 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　酶联免疫吸附试验是一项临床上已普及的检测技术，这一技术将抗原或抗体包被于固相支持物上，将酶标抗原或抗体加入抗原抗体复合物中，通过底物使酶显色来达到检测目的。不同的研究人员会采用不同的酶联免疫吸附试验策略，如使用单克隆多克隆抗体[17]及嵌合抗体[18]来开发肿瘤标志物检测试剂盒。酶联免疫吸附试验被开发后其检测系统得到不同的优化，如凝集素及生物素-亲和素系统[19]在酶联免疫吸附试验中的应用大大增强了其检测的敏感性，荧光素酶夹心酶联免疫吸附试验系统[20]也使检测的敏感性不断增强。酶联免疫吸附试验不仅适用于对单一分析物的测定，在多个分析物同时存在时，同样具有良好的适用性[21]。 /p p style=" text-align: justify " 　　除酶联免疫吸附试验外，越来越多的研究集中于开发具有酶样活性的模拟酶[22]。ZHANG等[23]以Cu2+作为助催化剂，利用Cu2+/Ag-AgI复合物作为催化剂具有在可见光下使3，3´ ，5，5´ -四甲基联苯胺(3，3´ ，5，5´ -tetramethylbenzidine，TMB)颜色产生变化的特性，构建了夹心型比色法，通过监测TMB溶液的颜色变化以定量癌胚抗原的水平，其开发的比色免疫测定在血清样品分析中表现出良好的选择性、重复性和稳定性。 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 4、免疫传感器 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　免疫传感器一直备受肿瘤研究者关注和青睐。将特异性免疫反应与生物传感技术相结合形成的生物传感器，其生物识别部分来自抗原与抗体的特异性识别和结合作用，通过理化换能器和信号放大装置将生物信号转变为电信号用于检测。与其他几种检测方法相比，免疫传感器具有灵敏度高、操作方便、设备简单、成本低、可实现实时动态检测等优势。目前，免疫传感器大部分处于试验阶段，正向高通量、商品化发展，以满足临床大样本检测的要求，随着技术的不断成熟，有望成为肿瘤标志物的新型检测手段。检验医学网 /p p style=" text-align: justify " 　　金属纳米材料由于拥有独特的光学、电子和催化特性常被用于构建免疫传感器[24，25]。LIU等[26]使用多孔铂纳米颗粒和PdPt纳米笼同时测定肿瘤标志物癌胚抗原和甲胎蛋白，利用多孔铂纳米颗粒较大的表面积和较强的导电性，PdPt纳米笼优异的催化性能及高负载能力，增强和放大响应信号，实现了对双重分析物的灵敏测定。另外，使用纳米合金材料制作的传感器，与使用单一金属材料相比具有更好的生物相容性，金属之间良好的协同作用使传感器催化性能进一步被放大。ZHANG等[27]使用PdPt纳米颗粒，以石墨烯片和多壁碳纳米管作为传感平台，组成纳米复合物修饰电极，来测定肿瘤标志物潜伏膜蛋白-1，比单独使用Pd纳米粒子具有更高的过氧化物酶活性，PdPt凹面不仅可以提供较大的表面积，还可以提供更丰富的催化反应活性位点。 /p p style=" text-align: justify " 　　碳纳米材料，包括单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、石墨烯、碳纳米纤维、碳球等，由于其良好的力学性能、较高的化学稳定性、特殊的电学性质、优异的机械性能和良好的导热性被广泛用于免疫传感器的制造，制造的传感器具有响应速度快、电子传递速率高、负载量大、吸附性好、催化活性等优点。LIANG等[28]研制了以双层酶修饰碳纳米管作为标记的夹心型免疫传感器，利用层层自组装技术将辣根过氧化物酶装配到多壁碳纳米管上，实现了信号放大，为临床分析的超灵敏检测提供了有力的支持。 /p p style=" text-align: justify " 　　聚合物复合材料由于良好的氧化还原性能，被作为免疫传感器信号指示剂[29，30]。TANG等[31]用聚多巴胺-PB2+(PDA-Pb2+)纳米复合材料作为氧化还原体系，用壳聚糖-金纳米复合材料涂覆电极，对癌胚抗原进行敏感性的电流分析。利用聚合物复合材料制作的免疫传感器，因聚合物复合材料掺杂带来的半导体或导体性质，其活性可被调节，掺杂/去掺杂的可逆过程使其可检测不同的分析对象，扩大了检测范围。 /p p style=" text-align: justify " 　　免疫传感器的制备除上述几种材料外，还常引入其他具有不同功能的材料来提高性能。如利用量子点高表面活性、小尺寸及对光、电、温度等敏感的特性，构建的传感器灵敏度较高[32，33] 利用磁性纳米粒子的磁效应构建的传感器抗干扰性好[34] 利用介孔材料良好的孔隙结构和界面结构构建的传感器，能够保持酶良好的活性和功能性 利用水凝胶构建的传感器稳定性好，水溶性高，能够对外界刺激产生响应并产生相应变化[35]。此外，利用羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)纳米颗粒，利用HAP-NPs与钼酸盐的反应检测甲胎蛋白，构建的传感器选择性好、灵敏度高，且成本低[36]。 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 5、蛋白组学 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　蛋白组学是近年来兴起的肿瘤研究领域热点之一，以蛋白质为核心，对蛋白质的表达模式和功能模式进行研究。蛋白组学技术具有高通量、微型化、自动化的优势，目前被广泛用于临床肿瘤学研究，为肿瘤标志物的研究提供了良好的平台，但同时具有检测成本昂贵、对技术人员操作要求高等缺点。 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " ①双向电泳 /span /p p style=" text-align: justify " 　　双向电泳是蛋白组学的经典技术，是利用蛋白质的等电点和不同相对分子质量来分离蛋白质的一门技术。双向电泳是蛋白组学的核心技术之一，能够通过染色强度得到蛋白质翻译后修饰的信息，能够同时分离数千种蛋白质。但其有不能分辨低拷贝数蛋白、检测蛋白比估计总蛋白数少、耗时长、操作过程繁琐等缺点，不能实现完全自动化，研究者常将其与质谱技术联用以分离、鉴定蛋白质[37]，即将蛋白质用双向电泳分离后，运用质谱技术进行逐一鉴定，这也成为蛋白组学研究的核心技术。相差凝胶电泳在双向电泳的基础上利用不同的染色对2个样本进行标记，通量更高，提高了凝胶间的可比性，工作效率得到提升。 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " ②质谱技术 /span /p p style=" text-align: justify " 　　质谱技术是将物质离子化，根据不同质荷比进行时间和空间的分离，进而获得样品的相对分子质量、分子结构等多种信息的分析方法。由于其具有高分辨力、高精度等特点被广泛用于多个领域。近年来，常用色谱-质谱技术，因其兼具了色谱的分离能力和质谱的鉴定能力，能够对蛋白质进行准确、快速的分析和定量[39，40]。基质辅助激光解吸飞行时间质谱和电喷雾电离质谱是经过改进的质谱技术，前者利用基质吸收激光的能量，得到肽质量指纹谱，通过检索数据库以鉴定蛋白质 后者利用电喷雾法，液相化多肽以鉴定蛋白质。这2种方法能保证电离时样品分子的完整性，不会使离子碎片化。检验医学网 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " ③蛋白质芯片 /span /p p style=" text-align: justify " 　　蛋白质芯片是近十年来新兴的分析技术，即在支持物表面排列蛋白质探针以捕获目标蛋白，再通过检测器进行定性或定量分析。根据载体性质不同，可分为固相蛋白质芯片和液相蛋白质芯片，临床上常用来筛选和寻找肿瘤标志物。反相蛋白质芯片也是蛋白组学高通量方法[41]。蛋白质芯片不仅可用来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，还可研究蛋白质与核苷酸间的相互作用，具有通量高、速度快、灵敏度高的优点。DUAN等[42]设计了一种蛋白质芯片，使用胶体纳米金标记葡萄球菌属蛋白A作为指标，应用免疫金银染色增强技术扩增检测信号，此蛋白质芯片可在不存在交叉反应的情况下检测乙型肝炎病毒抗体和丙型肝炎病毒抗体，并可在40min内提供结果，速度相对酶联免疫吸附试验等方法更快。YANG等[43]开发了一种微阵列芯片，首次使用硅和水凝胶作为微阵列的载体，构成的芯片具有二氧化硅和水凝胶两者的优点。 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " ④表面增强激光解析及电离飞行时间质谱 /span /p p style=" text-align: justify " 　　表面增强激光解析及电离飞行时间质谱是将质谱与蛋白质分离技术相结合的技术，能够检测到其他传统方法检测不到的蛋白质，只需少量样品，检测时间短且重复性高，可分析复杂样品。该技术基于特殊芯片的表明增强吸附作用，将样品蛋白质吸附到芯片上后，将结合蛋白质解离成核电离子以绘制质谱图。将健康人与肿瘤患者的蛋白图谱进行比较，能够发现差异表达的蛋白质。JIN等[44]开发了一种对糖类抗原19-9正常的胰腺癌患者与健康或良性个体进行诊断和鉴别诊断的方法，使用与CM10芯片联合的表面增强激光解吸及电离飞行时间质谱分析相关样品，生成了具有不同蛋白质的诊断模型。 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 6、分子生物学方法 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　检测肿瘤标志物的分子生物学方法包括聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)、荧光原位杂交技术(fluorescencein situ hybridization， FISH)、逆转录PCR、单链构象多态性(single-strand conformationpolymorphism，SSCP)、多种测序技术等。分子生物学技术具有高通量，特异性强、敏感性高等优势，但也存在价格昂贵、检测周期长等缺点。 /p p style=" text-align: justify " 　　PCR是目前被广泛使用的一种简单、敏感、高效、特异和快速的，能在体外扩增DNA的技术。由经典PCR衍生出的技术被广泛应用于肿瘤标志物的检测，如逆转录PCR被用于口咽癌[45]、结直肠癌[46]、前列腺癌[47]、肺癌[48]等多种肿瘤的检测。甲基化特异性PCR是一种检测特异位点甲基化的技术[49]，检测DNA甲基化敏感性极高，KOIKE等[50]发现甲基化特异性PCR对于胃癌标志物的检出率高于逆转录PCR。此外，多种PCR衍生技术如扩增融合PCR、实时荧光定量PCR等也被运用于肿瘤标志物的检测。 /p p style=" text-align: justify " 　　FISH以标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，根据核酸碱基配对原理，将标记的探针与单链核酸片段配对，在荧光显微镜下观察目标序列的分布。FISH虽属于低通量检测，但目前已被用于检测肿瘤细胞[51]、突变染色体[52]、染色体重排[53]，在肿瘤生物标志物检测和个体化医疗方面具有重要意义。 /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" color: rgb(0, 32, 96) " strong 7、液体活检 /strong /span /p p style=" text-align: justify " 　　液体活检是一种从血液等非实性样本中取样，用于诊断和检测肿瘤的方法。液体活检技术主要包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cell， CTC)检测、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)检测、外泌体检测等。与组织活检相比，液体活检能够早期筛查、检测肿瘤标志物，克服了肿瘤的时空异质性，具有无创、易反复取样、操作简便、可实时监控等优点，但同时也有价格昂贵、检测标准不统一等缺点。CTC检测目前主要使用的是免疫细胞化学方法，但CTC极低的丰度及其异质性使其面临着技术挑战。ctDNA检测主要采用分子生物学方法，但ct DNA具有易降解、含量低等缺点，为精准检测带来困难。外泌体检测在肿瘤诊断方面显示出良好的应用前景，是具有发展潜力的诊断方法，但其提取及操作尚无统一流程，检测系统有待进一步完善，以满足临床大规模样本检测的需要。检验医学网 /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 总结 /strong /p p style=" text-align: justify " 　　肿瘤标志物作为临床上肿瘤辅助诊断、治疗参考以及预后判断的重要指标，目前在应用上愈发广泛，临床对检测技术的要求也不断发展。不仅有大量灵敏度或特异性更高的标志物被发现，而且在检测方法上也紧跟临床工作需求而不断发展。不同检测方法均有其优势与不足，如何对不同方法进行整合，提高肿瘤标志物的检出能力，是研究者们需关注和探索的问题。能够在肿瘤早期检出低含量肿瘤标志物，永远是临床肿瘤诊断的主要需求。不管使用何种材料，使用何种方法，提高检测的敏感性和特异性及稳定性永远是肿瘤标志物研发所追求的目标。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 参考文献 /strong /p p 　　[1]GERDTSSON A S, WINGREN C, PERSSON H, et al. 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