乳酰胺

附件牛乳中非法添加β-内酰胺酶检测方法随着国家对食品安全问题的关注和部分乳制品企业2010年无抗奶目标的提出，抗生素残留问题成为影响乳制品安全的重要因素之一。目前，青霉素作为β- 内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选药物，是牛奶中最常见的残留抗生素。由于国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购的原则，出于经济利益的驱动，一些不法奶站为了谋求自己的经济利益，人为的使用一些生物制剂去降解牛乳中残留的抗生素，生产人造“无抗奶”。2005年至今，已有数家公司公开宣称出售分解牛乳中残留抗生素的解抗剂。迄今为止，还没有针对这种人造“无抗奶”的相应检测方法、检测标准，无法从源头上监测、把控原奶质量。奶制品中三聚氰胺问题出现后，检科院按照国家局科技司的安排，对奶制品中可能的添加物进行了调查。经过前期的调研工作，初步判断市售解抗剂的主要成分是β-内酰胺酶，它是由革兰氏阳性细菌产生和分泌的，可选择性分解牛奶中残留的β- 内酰胺类抗生素。β-内酰胺酶为我国不允许使用的食品添加剂,该酶的使用掩盖了牛奶中实际含有的抗生素。β-内酰胺酶能够使青霉素内酰胺结构破坏而失去活性，导致青霉素、头孢菌素等抗生素类药物耐药性增高，从而大大降低了人们抵抗传染病的能力，给消费者的身体健康带来危害。微生物方法和理化方法均利用β-内酰胺酶能够裂解青霉素的β-内酰胺环形成青霉噻唑酸的原理检测乳制品中是否添加解抗剂。一、理化方法（一）高效液相色谱法1、间接法方法原理：利用β-内酰胺酶能够酶解青霉素的原理，向牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定浓度的β-内酰胺酶，那么青霉素经β-内酰胺酶酶解后浓度会减少，从而判断牛奶中是否存在β-内酰胺酶。实验步骤：称取20 g试样，在4℃、16000rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，并将塑料离心管置于37℃水浴锅中振荡孵育30 min。向孵育后的离心管中加入无水乙醇15 mL。振荡提取30 min后离心，将上层清液过滤纸后收集于梨形瓶中。减压浓缩蒸发掉乙醇。向旋蒸后的梨形瓶中加入10 mL磷酸盐缓冲液（pH=8.5），涡旋1 min后调节pH为8.5。以1 mL/min的速度将提取液通过经过预处理的Oasis HLB固相萃取柱，用2 mL磷酸缓冲液（pH=8.5）淋洗萃取柱，再用2 mL水淋洗。最后用3 mL乙腈洗脱。将洗脱液在40℃下氮气吹干，用0.025 M磷酸盐缓冲液（pH=7.0）定容残渣至1 mL,待上机测定。色谱条件：色谱柱 Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；流动相 甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；检测波长 268 nm讨论：该方法只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；前处理方法相对复杂、费时。2、直接法方法原理：牛乳中的青霉素钾在β-内酰胺酶的作用下，主要生成青霉噻唑酸钾，并伴随生成少量的青霉胺、青霉醛等物质。经去脂肪、蛋白等前处理后，可以将青霉噻唑酸钾提取出来，经高效液相色谱仪检测确认其是否存在，从而判定该牛乳是否为人造“无抗奶”。实验步骤：称取20 g试样，在4 ℃、16000 rpm条件下离心10 min。取下层清液10 g于50 mL塑料离心管，加入无水乙醇15 mL，振荡提取30 min后离心，取清液经0.45 μm的滤膜过滤，用高效液相色谱仪检测。标准溶液配制：称取0.01 g（精确至0.001 g）青霉素钾于100 ml容量瓶中，加入1ml市售抗生素分解剂，室温放置2h使青霉素钾酶解完全后用去离子水定容，得到青霉噻唑酸钾标准溶液，浓度100 μg/mL。根据实际情况稀释后使用。色谱条件：色谱柱 Agilent Zorbax SB C18，4.6mm×150mm×5μm；流动相 甲醇/0.004 M磷酸二氢钾（pH=4.5）＝40/60；检测波长 230 nm讨论：该方法通过检测酶解产物青霉噻唑酸，只能给出定性结论即牛奶中是否含有β-内酰胺酶，而无法给出确切定量结果即牛奶中含有β-内酰胺酶的量（U/ml）；青霉噻唑酸钾稳定性尚需进一步考察；实验成本较生物学方法高。

文/ 华测检测[b]引言[/b]随着人们生活水平的不断改善，人们越来越注重食品的营养和健康,对乳品的需求也越来越大。但近几年来，乳品质量安全的事故时有发生，给我国乳品市场造成了很大的冲击，乳及其乳制品的食品安全问题也越来越备受关注，然而奶源质量不高成为阻碍我国奶业健康发展的一个重要因素，其中最突出的问题就是鲜奶抗生素的残留。世界各国对鲜奶抗生素的残留都有严格的管控，并有明确的法令禁止抗生素残留超标的牛奶上市销售，我国于2002年颁布的农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》对生鲜乳中的抗生素残留限量做出明确要求和规定。然而，目前仍有一些不法奶站和牧场出于经济利益的驱动，人为的向生鲜乳中添加一些生物制剂去降解生鲜乳中残留的抗生素，制造“无抗奶”，逃避乳品企业对抗生素的筛查及政府监管，造成严重的食品安全危害。本文针对生鲜乳中β-内酰胺酶的来源、危害、目前的管控及主要检测方法做一下阐述。[b]1 β-内酰胺酶简介[/b]β-内酰胺类药物主要是指青霉素类药物和头孢菌素类药物，是目前牧场使用的主要兽药种类，主要用于治疗奶牛乳房炎疾病和产后疾病，由于使用频率高，使用量大，导致β-内酰胺类兽药成为目前生鲜乳中最常见的残留抗生素。β-内酰胺酶俗称抗生素分解剂，又名解抗剂或者金玉兰酶制剂，以青霉素为底物的称为青霉素酶，以头孢菌素作为底物的称为头孢菌素酶。研究表明，有多种细菌能产生β-内酰胺酶，细菌菌体内产生的β-内酰胺酶能够裂解青霉素和头孢菌素等β-内酰胺类抗生素化学结构中的β-内酰胺环，从而灭活该类抗生素使其变成无抗菌活性的物质，从而表现出产酶细菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药性。生鲜乳中的β-内酰胺酶分为内源性和外源性。内源性β-内酰胺酶较为复杂，种类较多，有200多种，主要为革兰氏阴性菌产生。内源性β-内酰胺酶来源有两种途径：一是牛本身感染了某些有抗性的细菌，而这些细菌在体内不断表达分泌β-内酰胺酶，这些β-内酰胺酶随奶牛挤奶进入生鲜乳中；二是生鲜乳在放置过程中，由于放置时间和存放温度的原因，在某些细菌的作用下产生内源性β-内酰胺酶。外源性β-内酰胺酶主要为革兰氏阳性菌产生，包括青霉素酶和头孢菌素酶，外源性β-内酰胺酶是不允许在食品中使用的化学物质。生鲜乳中违法添加的抗生素分解剂是革兰氏阳性菌产生的β-内酰胺酶，是人为添加的，而不是内源性β-内酰胺酶。[b]2 生鲜乳中添加β-内酰胺酶的危害[/b]尽管β-内酰胺酶对人体造成的直接损伤和危害目前没有确切的研究能够证明，但是生鲜乳中β-内酰胺酶残留对人体健康和奶业健康产生了一定的安全风险。目前对青霉素药物产生过敏反应的人群普遍存在，通过研究发现主要机理为两个方面：一方面是β-内酰胺酶可催化分解青霉素化学结构中的β-内酰胺四元环，使四元环开环，从而使青霉素失去杀菌能力，同时青霉素降解产物青霉素噻唑酸可与人体内蛋白质结合形成大分子抗原而导致过敏反应；另一方面，β-内酰胺酶催化青霉素化学结构中的β-内酰胺环开放，开环后的β-内酰胺环极易交联在一起，高度聚合形成高度聚合物，该高聚物有很强的致敏能力，很容易导致人体的过敏反应。另外，β-内酰胺酶分解其他β-内酰胺类抗生素后会产生大量的降解产物，这些降解产物中有许多是抗生素的类似物，而降解产物对人体是否存在危害，目前仍是个未知数，这些都是潜在的危害风险。若长期饮用含有β-内酰胺酶处理的牛奶，会使人体内的致病菌产生耐药性，当人体被感染需要使用抗生素药物治疗时，会使抗生素药物失去作用。此外，长期饮用含有β-内酰胺酶的牛奶还可能会引入其他的致病菌、致癌物质。另一方面，β-内酰胺酶的添加纵容了奶牛饲养过程中抗生素的滥用，扰乱市场，不利于我国奶业的健康可持续发展。[b]3 生鲜乳中β-内酰胺酶的管控[/b]2008年婴幼儿奶粉三聚氰胺事件发生后，乳与乳制品的质量安全问题越发的引人关注，国家也相继出台了针对食品中非法添加物质的各项管控政策。β-内酰胺酶可能添加到乳与乳制品中，起到分解抗生素的作用，由于乳与乳制品中添加β-内酰胺酶存在很大的食品安全风险，有可能对人体健康造成严重危害，因此国家出台相关的法律法规明令禁止在生鲜乳中添加此类物质，但是仍有部分国内的奶站和牧场为了追求经济利益，为了使被抗生素污染的生鲜乳达到“无抗”的标准, 在牛奶中人为添加β-内酰胺酶分解剂，给我国奶制品市场造成了混乱，损害了消费者的利益。为进一步保障乳与乳制品的质量和食品安全，打击食品中的各种违法添加，2008年11月28日国家发布“关于开展全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治的紧急通知”（卫监督发〔2008〕60号），该通知由卫生部、商务部、公安部、监察部、工商总局、工业和信息化部、农业部、质检总局和食品药品监管局联合发布，形成统一执法，通知指出：“当前在食品中违法添加非食用物质和滥用食品添加剂问题十分严重，对人民群众身体健康和生命安全造成极大威胁，严重损害了我国食品产品的声誉。”2009年2月4日，全国食品安全整顿工作办公室印发《食品中可能违法添加的非食用物质名单（第二批）》的通知(食品整治办〔2009〕5号)，明确将β-内酰胺酶列入乳与乳制品中违法添加的非食用物质，进行全国性监控。2009年3月6日，卫生部印发《卫监督发〔2009〕21号》文件，该文件在《全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治近期工作重点及要求》中明确指出在乳及乳制品生产中添加β-内酰胺酶的违法行为是专项整治近期工作的重点。近几年，在农村农业部的牵头带领下，各省市自治区相继开展针对生鲜乳违法添加专项整治行动，同时国家监督抽查和风险监测等食品安全监控工作均把β-内酰胺酶作为重点监控项目进行抽检监控，并针对发现的少数违禁添加行为及时进行了处置。[b]4 生鲜乳中β-内酰胺酶的主要检测方法[/b]目前常用的β-内酰胺酶检测方法有微生物检测方法、免疫检测方法、液相/[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]/质谱联用检测方法，他们各有优缺点。微生物法是在规定条件下选用适当微生物测定某种物质含量的方法，微生物法中经典的检测β-内酰胺酶的方法为杯碟法，这种方法优点是成本低廉、准确性好，缺点是检测时间较长，不能做到生鲜乳的快速检测放行。目前微生物法仍作为β-内酰胺酶的主要检测方法，国家和地方标准仍以微生物检测方法为主要检测方法，涉及到的主要标准检测方法有DB13/T 1080-2009 乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定（2009年5月27日由河北省质量技术监督局颁发的地方标准）；乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法-杯碟法（2009年3月23日由卫生部在“关于印发全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治抽检工作指导原则和方案的通知(食品整治办〔2009〕29号)”中发布）；SN/T 3979-2014 乳及乳制品中β-内酰胺酶的测定方法-杯碟法（2014年7月14日由国家质量监督检验检疫总局颁发的进出口行业标准）；NY/T 3313-2018 生乳中β-内酰胺酶的测定第一法（2018年12月19日由农业农村部颁发的农业标准）。免疫检测法是根据抗原抗体特异性反应的基本特性而设计的检测方法，优点是操作简单、速度快、特异性强，缺点是费用较高，容易出现“假阳性”。免疫检测法目前是在生鲜乳β-内酰胺酶快检方面应用比较广泛的检测方法，主要应用于乳品企业在生鲜乳收购时快速检测放行，目前最主要的技术是胶体金免疫层析技术，现主要以商品化试剂盒为主。目前胶体金免疫层析技术涉及到的主要标准检测方法有SN/T 4533.1-2016 商品化试剂盒检测方法β-内酰胺酶方法一（2016年6月28日由国家质量监督检验检疫总局颁发的进出口行业标准）；NY/T 3313-2018 生乳中β-内酰胺酶的测定第二法（2018年12月19日由农业农村部颁发的农业标准）。液相/[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]/质谱联用检测方法为近几年新兴的β-内酰胺酶检测方法，该方法准确性好、敏感性强、重现性好，但检测程序较为复杂，对于样品前处理具有较高的要求，检测费用较高。目前，利用高效液相色谱法测定乳制品中β-内酰胺酶残留的方法已经较为成熟，但仍没有形成相应的国标方法。对于生鲜乳中β-内酰胺酶的液相检测方法主要有两种：直接法和间接法。直接法的主要原理是在含有β-内酰胺酶的条件下或者碱性条件下，青霉素钾盐（钠盐）才能分解为青霉噻唑酸钾（钠），通过测定青霉噻唑酸钾（钠）含量来测定β-内酰胺酶含量；；间接法则是向生鲜乳中添加已知量的青霉素，经过一段时间孵育后，测定青霉素的含量，通过青霉素含量的变化来判断生鲜乳中是否含有β-内酰胺酶，如果含有β-内酰胺酶，青霉素的含量则会下降。液相/[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相[/url]/质谱联用检测方法可对β-内酰胺酶进行高通量定量检测，故常可用于实验室定量分析，但是因为需要专门人员进行操作、前处理比较复杂、所需设备比较昂贵等原因，在一些小实验室使用频率不高，且不适用于现场检测。[b]小结[/b]食品安全问题事关人的健康和生命，已经成为全社会关注的热点，生鲜乳质量安全是乳品质量安全最重要的因素。如何确保生鲜乳质量安全，杜绝各种违法现象的发生：一方面，需要政府部门建立健全奶业法规、标准，同时加强政府监管和监督抽检，严厉打击食品中的各种违法添加行为；另一方面，需要政府相关部门、乳品加工企业加大生鲜乳检测力度，投资配备先进生鲜乳检测设备，优化和研发对应的检测方法，引进先进的质量管理体系，落实各个关键控制点质量控制，同时开展第三方检测。通过以上措施，确保收购质量安全的生鲜牛奶，才能保证乳品加工厂生产出高质量安全的乳制品，确保消费者的健康安全。

乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法指定检验方法4.乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法杯碟法1、范围本标准规定了乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物的检验方法。本标准适用于乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类物质的检验。本方法的检出限为4U/mL。2、原理该方法采用对青霉素类药物绝对敏感的标准菌株，利用舒巴坦特异性抑制β-内酰胺酶的活性，并加入青霉素作为对照，通过比对加入β-内酰胺酶抑制剂与未加入抑制剂的样品所产生的抑制圈的大小来间接测定样品是否含有β-内酰胺酶类药物。3、设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 抑菌圈测量仪或测量尺。3.2恒温培养箱：36℃±1℃。3.3 高压灭菌器。3.4 无菌培养皿:内径90 mm，底部平整光滑的玻璃皿，具陶瓦盖。3.5 无菌牛津杯：外径(8.0士0.1) mm，内径(6.0士0.1) mm，高度(10.0士0.1) mm。3.6 麦氏比浊仪或标准比浊管。3.7 pH计。3.8 无菌吸管：1mL（0.01mL刻度值），10mL（0.1mL刻度值）。3.9 加样器:5μL～20μL，20μL -200μL及配套吸头。4、培养基和试剂　除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的三级水。4.1 试验菌种：藤黄微球菌(Micrococcus luteus) CMCC(B) 28001，传代次数不得超过14次。4.2 磷酸盐缓冲溶液：按附录A中A.1规定。4.3生理盐水（8.5 g/L）：按附录A中A.2规定。4.4 青霉素标准溶液：按附录A中A.3规定。4.5 β-内酰胺酶标准溶液：按附录A中A.4规定。4.6 舒巴坦标准溶液按附录A中A.5规定。。4.7 营养琼脂培养基：按附录A中A.6规定。4.8 抗生素检测用培养基Ⅱ：按附录A中A.7规定。5、操作步骤5.1 菌悬液的制备将藤黄微球菌接种于营养琼脂斜面上，经36士1℃培养18h-24 h，用生理盐水洗下菌苔即为菌悬液，测定菌悬液浓度，终浓度应大于1×1010 CFU/mL，4 ℃保存，贮存期限2周。5.2 样品的制备将待检样品充分混匀，取1 mL待检样品于1.5 mL离心管中共4管，分别标为：A、B、C、D，每个样品做三个平行，共12 管，同时每次检验应取纯水1 mL加入到1.5 mL离心管中作为对照。如样品为乳粉，则将乳粉按1:10的比例稀释。如样品为酸性乳制品，应调节pH值至6-7。5.3 检验用平板的制备取90mm灭菌玻璃培养皿，底层加10 mL灭菌的抗生素检测用培养基Ⅱ,凝固后上层加入5 mL含有浓度为1×108 CFU/mL藤黄微球菌的抗生素检测用培养基Ⅱ,凝固后备用。5.4 样品的测定按照下列顺序分别将青霉素标准溶液、β-内酰胺酶标准溶液、舒巴坦标准溶液加入到样品及纯水中：A 青霉素5 μL。B 舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。C β-内酰胺酶25 μL、青霉素G5 μL。D β-内酰胺酶25 μL、舒巴坦25 μL、青霉素5 μL。混匀后，将上述A～D 试样各200 μL 加入放置于检验用平板上的4个无菌牛津杯中，36士1℃培养培养18～22 h ，测量抑菌圈直径。每个样品，取三次平行试验平均值。5.5 结果报告纯水样品结果应为：（A）、（B）、（D）均应产生抑菌圈；（A）的抑菌圈与（B）的抑菌圈相比，差异在3 mm以内(含3 mm)，且重复性良好；（C）的抑菌圈小于（D）的抑菌圈，差异在3 mm以上(含3 mm)，且重复性良好。如为此结果，则系统成立，可对样品结果进行如下判定：7.1 如果样品结果中（B）和、（D）均产生抑菌圈，且（C）与（D）抑菌圈差异在3 mm以上（含3 mm）时，可按7.1.1、7.1.2 判定结果。7.1.1（A）的抑菌圈小于（B）的抑菌圈差异在3 mm以上(含3 mm),且重复性良好，应判定该试样添加有β- 内酰胺酶，报告β- 内酰胺酶类药物检验结果阳性。7.1.2（A）的抑菌圈同（B）的抑菌圈差异小于3 mm，且重复性良好，应判定该试样未添加有β- 内酰胺酶，报告β- 内酰胺酶类药物检验结果阴性。7.2 如果（A）和（B）均不产生抑菌圈，应将样品稀释后再进行检测。附 录 A（规范性附录）培 养 基A.1 磷酸盐缓冲溶液（pH6.0）无水磷酸二氢钾8.0 g无水磷酸氢二钾2.0 g蒸馏水加至1000 mLA.2 生理盐水（8.5 g/L）氯化钠8.5 g蒸馏水1000 mL121℃高压灭菌15 min。A.3 青霉素标准溶液准确称取适量青霉素标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为0.1mg/mL的标准溶液。当天配制，当天使用。A.4 β-内酰胺酶标准溶液准确量取或称取适量β-内酰胺酶标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为16000 U/mL的标准溶液。当天配制，当天使用。A.5 舒巴坦标准溶液准确称取适量舒巴坦标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为1 mg/mL的标准溶液，分装后-20 ℃保存备用，不可反复冻融使用。A.6 营养琼脂蛋白胨10 g牛肉膏3 g氯化钠5 g琼脂15-20 g蒸馏水1000 mL将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，分装试管每管约5~8 mL，120℃高压灭菌15 min，灭菌后摆放斜面。A.7 抗生素检测培养基Ⅱ蛋白胨10 g牛肉浸膏3 g氯化钠5 g酵母膏3 g葡萄糖1 g琼脂14 g蒸馏水1000mL将上述成分加入蒸馏水中，搅混均匀，120 ℃高压灭菌15 min，其最终pH 值约为6.6。