质谱片段分析

大家好，本周为大家分享一篇文章，Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody−Drug Conjugates [1]，文章的通讯作者是加州大学洛杉矶分校化学与生物化学系的Joseph A. Loo教授。　　抗体-药物偶联物(Antibody - drug conjugates, ADC)是一种很有前景的治疗药物，它通过linker为抗体提供高效的细胞毒性有效载荷，以提高其抗肿瘤功效。将linker和有效载荷偶联到抗体上，给ADC带来了额外的异质性，增加了对其全面表征的挑战。自上而下的质谱(TD-MS)技术近年来在单克隆抗体的表征中得到了广泛的应用，与自下而上质谱(BU-MS)和中下质谱(MD-MS)相比，TD-MS具有最简单的样品制备流程和保留单克隆抗体内源性修饰的优势。然而，对于抗体大小的蛋白质和具有显著二硫键组成的蛋白质，TD-MS的断裂效率较低，获得的序列和药物偶联位点信息有限。　　为了增加TD-MS的序列信息含量，一种策略是将不包含蛋白质序列N端和C端的内部片段纳入数据分析工作流程中，这种方法已被证明有助于二硫化完整蛋白的TD-MS表征。在这篇文章中，作者发现在TD-MS中分配内部片段将mAb序列覆盖率提高到75%以上，并允许确定链内二硫键连接和各种N-糖基化类型。对于治疗性非特异性赖氨酸连接ADC，几乎60%的假定药物偶联位点被识别。　　内部片段可以在不破坏二硫键的情况下进入结构紧密、碎片化效率高度受限的区域，因此有可能大大增强完整单克隆抗体的序列信息。作者对完整的NIST单抗的5个最丰富的电荷态采用了ECD和HCD两种碎片化方法，并将每个电荷态的两种碎片化方法的TD-MS结果结合分析。内部片段的纳入提高了二硫键约束区域的序列覆盖，例如，轻链Cys133和Cys193之间的二硫约束序列几乎完全由内部片段覆盖(图2A)，重链的Cys147-Cys203和Cys264-Cys324序列区也是如此(图2B)，而这些区域是末端片段难以触及的。CDR的覆盖率从53%增加到60%，这表明纳入内部片段可以更深入地了解这一关键区域。总体来说，轻链的序列覆盖率从54%提高到83%，重链从28%提高到72%，合并后整个NIST单抗的序列覆盖率从36%增加到76%(图1)。重链比轻链的覆盖率提高更为显著，这表明随着蛋白质分子量增大，分配内部片段变得更有价值。　　图1. 考虑(A)轻链、(B)重链和(C)全单抗内部片段前后不同序列区域的序列覆盖率，包括非二硫约束序列(Free)、二硫约束序列(SS-constrained)、全序列(Full)和CDR序列(CDR)　　图2. (A)轻链和(B)重链的NIST mAb序列覆盖图谱。蛋白质骨架上的蓝色、红色和绿色切割分别代表b/y、c/z和by/cz片段。序列上方的实线表示末端片段序列覆盖率，序列下方的实线表示内部片段序列覆盖率。紫色虚线表示链内二硫键，浅灰色表示受二硫键约束的序列区域，橙色表示互补决定区域(cdr)。　　HCD能够在不破坏二硫键的同时仅碎裂蛋白质主干，因此作者在完整的NIST单抗上应用HCD来生成含有完整二硫键的片段，以确定二硫键连接。在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上应用-1H的修饰，以表明它们的完整性。对于轻链，52个末端片段和12个内部片段穿过S - S键I, 17个末端片段穿过S - S键II, 6个末端片段穿过两个二硫键，清楚地显示了这两个二硫键的连接模式(图3A)。靠近重链两端的两个二硫键，S - S键I和S - S键IV，被89个末端片段和9个内部片段穿过 而中间的两个二硫键，S−S键II和S−S键III，只有24个内部片段穿过，没有末端片段穿过(图3B,C)。这些结果证明了NIST单抗重链的链内S - S连通性，重要的是，中间的两个S - S键模式只能由内部片段确定。除了确定链内S - S连通性外，分配内部片段也有助于鉴定N糖基化。当纳入内部片段时，额外分配了25个含有G0F的片段，42个含有G1F的片段和34个含有G2F的片段，这表明分析内部片段对N-糖基化鉴定的能力。　　图3. (A)轻链、(B)重链、(C)仅含完整NIST单抗内部片段的重链，在每个形成链内二硫键的半胱氨酸上施加一个氢损失后，通过HCD TD-MS生成片段位置图。　　内部片段可以确定赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。作者采用了类似的方法，将ECD和HCD应用于先前已充分表征的非特异性赖氨酸连接ADC。ADC的TDMS在轻链上仅产生8个与DM1结合的末端片段(图4A)。分配内部片段显著提高了DM1偶联位点的测定。ADC的TD-MS在轻链上产生61个1- dm1结合和15个2 - dm1结合的内部片段，定位了3个偶联位点(K106, K114, K133)，并将鉴定的两个偶联位点缩小到4个赖氨酸残基(K153, K160, K170, K175)(图4A)。对于重链也观察到类似的结果。综上所述，对于完整的ADC，仅用末端片段确认了16个偶联位点，而在包含内部片段后，这一数字增加到52个，覆盖了约58%的抗体所有假定的偶联位点。　　图4. 由ECD和HCD TDMS生成的完整IgG1-DM1 ADC (A)轻链和(B)重链片段位置图。黑色垂直虚线表示赖氨酸的位置。　　在这项工作中，作者首次报道了在完整的NIST单抗和异质赖氨酸连接ADC的TD-MS表征中分析内部片段的好处。内部片段的包含末端片段难以达到的二硫键约束区域，显著增加了完整单克隆抗体的序列覆盖率。重要的PTM信息，包括二硫键模式和N糖基化，可以通过包含内部片段获得。最重要的是，内部片段可以帮助确定高度异质赖氨酸连接ADC的药物偶联位点。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：Added Value of Internal Fragments for Top-Down Mass Spectrometry of Intact Monoclonal Antibodies and Antibody-Drug Conjugates

药品与我们的生活密不可分。新药研发一方面关系着全人类的健康需求，另一方面也关系着国家经济与社会的发展需求。 据权威统计，单一药物上市的成本超过十亿美元，整个过程花费约十年的时间，药物筛选的失败率高达97%。但药物筛选是新药研发中至关重要的一步，确定靶标分子及筛选模型是现代新药开发的基础。它主要有两种方式，表型筛选（Phenotypic drug discovery, PDD）和靶点筛选（Target-based drug discovery，TDD）。PDD的起点是一个化合物库或抗体库，用一个和疾病高度相关的临床前模型或者实验来筛选库中的药效，找到达到期望药效的分子再进一步优化和开发。经典的药物表型筛选更多的是基于动物疾病模型的筛选，实验选择遗传背景明确或者来源清楚的动物，例如鸡、猪、狗、猫、鼠、蛙、蛇、猴子、鱼、果蝇、线虫等。TDD则是基于对疾病和靶点机理的理解，针对某一个和疾病机理高度相关的特定的靶点，从而有针对性的设计大分子或小分子药物的研发方式。由于表型筛选无法提供活性化合物作用靶标信息, 因此需要利用化学蛋白组学回溯鉴定那些因与小分子药物直接发生作用而引起功能改变的蛋白质，在分子水平上系统揭示特定蛋白质的功能以及蛋白质与化学小分子的相互作用, 从而准确找到药物的作用靶点。旨在建立药物活性与细胞表型之间的联系，阐明药物的作用机理，一方面探究药物的脱靶效应和耐药性机制, 提高药物发现的效率；另一方面在药物研发的早期阶段预测潜在的副作用和毒性, 从而降低药物研发失败的风险。　化学蛋白质组学研究方法的一般流程是, 先将化学探针或小分子化合物与蛋白质提取液进行共孵育,然后利用亲和层析等方法将这些蛋白质分离,再通过高灵敏度的质谱鉴定, 最后对它们做进一步的生物信息学分析。1. 基于活性的蛋白质谱分析 (activity-based protein profiling, ABPP)ABPP利用基于靶酶活性的特异化学小分子探针 (activity-based probes, ABPs) 来探测功能蛋白质组, 利用活性小分子探针来识别蛋白质靶点。分子探针是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用并能被特殊方法所检测的分子。ABP 的设计通常包括两个基本组成部分:“反应基团”和“报告基团” , 一般通过碳链或者聚乙二醇链将二者连接在一起. 反应基团通常是具有独特化学结构的亲电性化学小分子, 能够选择性地与蛋白质组中某一类蛋白酶的活性中心结合, 并与其中执行重要催化功能的亲核性氨基酸发生反应, 从而将探针分子共价地标记在靶标蛋白上。活性分子探针结构示意图2. 药物亲和致靶点稳定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）DARTS通过对比药物处理组与DMSO对照组蛋白质酶解片段的差异，找出酶解情况不同的蛋白质，再进行结合特异性分析，找出特异结合的靶标。DARTS实验步骤这种方法的优点是, 仅依靠药物和蛋白直接结合而并不需要对小分子化合物进行修饰, 从而确定出小分子的任意靶点。因此, 可采用小分子稳定其靶蛋白的结构从而导致蛋白酶抵抗, 结合质谱分析法发现未知靶点。DARTS 可将具有生物活性的天然产物提取物在分离之前就用于靶点发现,多用来研究多靶点药理学以及复方中成药物。3.细胞热转变分析（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）CETSA是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验，其原理是靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定。即随着温度的升高，蛋白会发生降解；当蛋白结合药物后，相同温度下，未降解蛋白的量会提高，该复合蛋白的热熔曲线会右移。用溶解蛋白质的量作温度的函数可以得到蛋白质的变性曲线，由此可以确定蛋白质的变性温度点或蛋白质的熔点。CETSA实验的样品来源，可以是细胞，也可以是组织样本，检测方法主要有Western blot和MS。该技术能在天然的细胞环境中进行，也无需对目标分子和蛋白进行任何修饰以及标记。CETSA实验步骤目前已证实该技术能识别许多已知的抗癌试剂的靶点，如在细胞裂解液、完整细胞或组织样本中均鉴定出多个药物的作用靶标。然而，CETSA方法不适用于高度不均匀的蛋白质或蛋白质配体结合域的结构展开，并不会诱导蛋白的聚集和变性的情况，如DNA和伴侣蛋白质的结合。有研究将cellular thermal shift assay与质谱联用（MS-CETSA），可以同时监测整个蛋白质组在药物作用下蛋白质稳定性的变化，因此可以鉴定出与药物相互作用的蛋白质，而不需要预先知道药物的作用通路或机制。MS-CETSA流程图4. 有限蛋白水解质谱（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）LiP-MS不需要对配体进行化学修饰，就可以实现在复杂的生物环境中鉴定药物靶标。实验步骤是用低浓度的非选择性蛋白酶K进行有限的蛋白水解，优先切割蛋白质暴露在外的柔性部分(环或者未折叠部分)， 经过变性和胰蛋白酶消化后，通过LC-MS分析肽混合物。基于LiP-MS的小分子图谱靶点的发现在整个药物研发过程中起着至关重要的作用。随着现代分子生物学技术的发展和人类基因组计划的完成，出现了大量可供治疗干预的新型分子靶点，但并不是所有的靶点都能够成为与疾病有关的有效靶点，因此对新型靶点进行发现和验证便成为非常重要的工作。

从人类基因组草图到完全图谱——论基因组重复片段研究作者：李东卫，张玉波（中国农业科学院农业基因组研究所，“岭南现代农业”广东省实验室，深圳 518120）2001年发表的人类基因组草图并没有包含全部的基因组序列，直到二十年后，科学家们才正式宣布完成了人类全序列基因组图谱，这其中主要的技术障碍就是重复片段的测序工作。重复片段（segmental duplications，SDs）是指广泛存在于基因组中的大于1 kb且序列相似性超过90%以上的大片段。它们可以通过基因组重排及拷贝数变异产生新基因和驱动进化，其大量存在于子端粒中，并与哺乳动物细胞复制性衰老以及癌症等重要生物学过程密切相关，一直以来备受科学家关注。但是其序列特点使得常规的测序技术难以完全准确测出全部序列，是基因组组装工作的一个难点。人类基因组全图谱的完成将重复片段在生物体进化、延缓衰老、疾病治疗等方面的研究提供基础。本文将就重复片段的重要性，研究的技术难点，研究现状以及未来展望等方面展开论述。重复片段的重要性重复片段是基因组中序列高度相同的大片段，具有广泛的结构多样性。它们占人类参考基因组（T2T-CHM13）中的7.0%，长度为218 Mbp[2 ]，在中心体及子端粒区域富集高达10倍。中心体所包含的5个典型重复为：α卫星，β卫星，CER卫星，γ卫星，CAGGG重复，以及重复子4。子端粒所包含的典型重复为：端粒相关重复（TAR）以及传统的（TTAGGG）n重复[4 ]。重复片段可以介导染色体重排，使常染色体和异染色体之间通过同源重组产生镶嵌类型的重复的染色质[5 ]。在最近新鉴定的人类重复片段中，Mitchell R等预测了182个新的候选蛋白编码基因，并使用T2T-CHM13基因组重构了重复基因（TBC1D3，SRGAP2C，ARHGAP11B），这些基因在人额皮质增生中具有重要作用，揭示了重复片段结构在人和他们近亲物种之间的巨大进化差异[6 ]。大量的染色体子端粒区含有重复片段[8 ]。复制性衰老被认为是一种抗癌机制，限制细胞增殖。长寿的有机体经历更多的细胞分裂，因此具有更高的产生肿瘤的风险。端粒酶能够增加端粒的长度，促进癌细胞不断增殖，因此长寿动物体细胞倾向于抑制端粒酶的活性，从而抑制肿瘤发生的风险[10 ]研究难点：大片段长度、多拷贝数、序列高度相似 重复片段的大的片段长度，多拷贝数以及序列的高度相似是长期以来其研究的难点。各种测序技术的发展致力于解决这个问题。重复片段长度范围是1到400 kb [12 ]。而且，标准的长读段校正工具，例如MUMmer 或Minimap2不能够有效的捕捉低相似的重复片段，也经常将重复片段与其它调控元件混淆[14 ]，为重复片段的研究带来机遇。尤其是PacBio的HiFi读段，具有长读段的同时还具有较高的准确度。但是，很多重复片段的长度要比HiFi读段的平均长度要长，因此很难完全准确的进行组装[3 ]。染色体重排，尤其是染色质断裂常发生在高GC区域[16 ]。同时，在T2T-CHM13基因组基础上，Mitchell R等首次进行了全基因组重复片段的研究。与当前人类参考基因组（GRCh38）鉴定的167 Mbp复制片段相比，鉴定了更多的（218 Mbp）非冗余重复片段（图2 a, b）。新发现91%的重复片段能更好地代表人的拷贝数，通过与非人灵长类基因组相比，前所未有的揭示了人类和其它近亲在重复片段结构中的杂合性以及广泛的进化差异[17 ]。图2 T2T-CHM13中新鉴定的染色体内（a）与染色间（b）的重复片段[1 ]。利用重复片段解析衰老机制未来可期新组装的T2T-CHM13的拷贝数比GRCh38高9倍，因此它能更好的呈现人类拷贝数变异。通过鉴定新基因的拷贝数变异，可筛选相应的药物治疗靶点。例如，CHM13鉴定到LPA、MUC3A、FCGR2基因的拷贝数变异与疾病相关[1]。此外，对于尚具争议的疾病标志基因，例如乳腺癌中ESR1 基因[18]，可以通过CHM13对其进行分子进化分析，进而鉴定其突变和扩增，确定其在乳腺癌中的作用。尽管端粒作为抗衰老靶标已研究多年，但是端粒长短变化与复制性衰老的关系仍不清楚。细胞减数分裂过程中端粒变短的机制是什么？重复片段拷贝数变异与端粒变短有无相关性？很多研究已证明端粒酶具有延长端粒长度的作用，具体的机制是什么？这些问题因此前端粒不能被准确测序而长期未解决。现在，人类基因组完全图谱已基本实现，相信这些谜团会很快解开。未来可以根据人类年龄增长过程中端粒重复片段的拷贝数变异，解析其抗衰老的机制。通过人为干预其拷贝数，可能用于探索生命的极限。1. Vollger MR, Guitart X, Dishuck PC, Mercuri L, Harvey WT, Gershman A, Diekhans M, Sulovari A, Munson KM, Lewis AM et al.Segmental duplications and their variation in a complete human genome. bioRxiv.2021:2021.2005.2026.445678.2. Prodanov T, Bansal V.Sensitive alignment using paralogous sequence variants improves long-read mapping and variant calling in segmental duplications. Nucleic Acids Research.2020 48(19).3. Bailey JA, Yavor AM, Massa HF, Trask BJ, Eichler EE.Segmental duplications: Organization and impact within the current Human Genome Project assembly. Genome research.2001 11(6):1005-1017.4. Courseaux A, Richard F, Grosgeorge J, Ortola C, Viale A, Turc-Carel C, Dutrillaux B, Gaudray P, Nahon JL.Segmental duplications in euchromatic regions of human chromosome 5: a source of evolutionary instability and transcriptional innovation. Genome research.2003 13(3):369-381.5. Giannuzzi G, Pazienza M, Huddleston J, Antonacci F, Malig M, Vives L, Eichler EE, Ventura M.Hominoid fission of chromosome 14/15 and the role of segmental duplications. Genome research.2013 23(11):1763-1773.6. Young E, Abid HZ, Kwok PY, Riethman H, Xiao M.Comprehensive Analysis of Human Subtelomeres by Whole Genome Mapping. PLoS genetics.2020 16(1):e1008347.7. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J, Devon K, Dewar K, Doyle M, FitzHugh W et al.Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature.2001 409(6822):860-921.8. Seluanov A, Chen ZX, Hine C, Sasahara THC, Ribeiro AACM, Catania KC, Presgraves DC, Gorbunova V.Telomerase activity coevolves with body mass not lifespan. Aging Cell.2007 6(1):45-52.9. Bromham L.The genome as a life-history character: why rate of molecular evolution varies between mammal species. Philos T R Soc B.2011 366(1577):2503-2513.10. Shay JW.Role of Telomeres and Telomerase in Aging and Cancer. Cancer discovery.2016 6(6):584-593.11. Sharp AJ, Locke DP, McGrath SD, Cheng Z, Bailey JA, Vallente RU, Pertz LM, Clark RA, Schwartz S, Segraves R et al.Segmental duplications and copy-number variation in the human genome. American journal of human genetics.2005 77(1):78-88.12. Hartasanchez DA, Braso-Vives M, Heredia-Genestar JM, Pybus M, Navarro A.Effect of Collapsed Duplications on Diversity Estimates: What to Expect. Genome Biol Evol.2018 10(11):2899-2905.13. Numanagic I, Gokkaya AS, Zhang L, Berger B, Alkan C, Hach F.Fast characterization of segmental duplications in genome assemblies. Bioinformatics.2018 34(17):i706-i714.14. Vollger MR, Dishuck PC, Sorensen M, Welch AE, Dang V, Dougherty ML, Graves-Lindsay TA, Wilson RK, Chaisson MJP, Eichler EE.Long-read sequence and assembly of segmental duplications. Nature methods.2019 16(1):88-94.15. Rhie A, McCarthy SA, Fedrigo O, Damas J, Formenti G, Koren S, Uliano-Silva M, Chow W, Fungtammasan A, Kim J et al.Towards complete and error-free genome assemblies of all vertebrate species. Nature.2021 592(7856):737-+.16. Nurk S, Koren S, Rhie A, Rautiainen M, Bzikadze AV, Mikheenko A, Vollger MR, AltemoseN, Uralsky L, Gershman A et al.The complete sequence of a human genome. bioRxiv.2021:2021.2005.2026.445798.17. Zhu Y, Liu X, Ding X, Wang F, Geng X.Telomere and its role in the aging pathways: telomere shortening, cell senescence and mitochondria dysfunction. Biogerontology.2019 20(1):1-16.18. Tabarestani S, Motallebi M, Akbari ME.Are Estrogen Receptor Genomic Aberrations Predictive of Hormone Therapy Response in Breast Cancer? Iranian journal of cancer prevention.2016 9(4):e6565.