那沙普酶

美国加利福尼亚州圣迭戈——2022 年 6 月 22 日，全球基因测序和芯片技术的领导者因美纳（纳斯达克股票代码：ILMN）宣布推出一项与默沙东（默沙东是美国新泽西州肯尼沃斯市默克公司的公司商号，在美国和加拿大以外被称为默沙东）共同开发的科研检测产品。该检测产品的诞生，源自于因美纳致力于推动精准医疗发展的承诺：广泛地实现全面的基因组分析，助力关键性研究的开展以推动实现肿瘤精准医疗。这一全新的检测产品在领先的、已商业化分发的TruSight™ Oncology 500的基础上，增加了对一种新的基因组特征的评估。未来，该产品将在全球范围内发行（不包括美国和日本），助力全球的科研工作者通过识别用于同源重组修复缺陷（HRD）评估的基因突变，进一步解锁肿瘤基因组。因美纳首席医学官 Phil Febbo 医学博士表示:“同源重组修复缺陷（HRD）状态已成为含有高度 DNA 损伤的肿瘤的重要生物标志物，包括卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等。通过单个样本和单次检测，TruSight Oncology 500 HRD 检测可以为实验室提供全面、精准、灵敏的结果，能够极大地提升我们对肿瘤基因组特性的认知。” TruSight™ Oncology 500 (仅供研究使用)检测是基于新一代测序（NGS）的综合性检测方法，利用成熟的因美纳 NGS 技术和Myriad Genetics（纳斯达克股票代码：MYGN）经验证的HRD 技术，助力实验室精准检测基因组不稳定性，同时分析 500 余种基因，包括与 HRD 状态相关的基因。HRD是一种基因组特征，用于描述细胞无法有效修复DNA双链断裂。当出现该特征时，细胞需要依赖备选的、容易出错的DNA修复机制，这可能会导致基因组不稳定性，并最终导致肿瘤的形成。慕尼黑工业大学的分子病理学诊断部门参与了 TSO 500 HRD 早期评估项目，将因美纳 TSO 500 HRD原型产品的检测结果与来自Myriad Genetics经验证的参考标准进行比较。“我们非常高兴因美纳推出了 TruSight Oncology 500 HRD检测产品，我们对早期评估项目的结果十分满意，”慕尼黑工业大学分子病理学诊断部门负责人 Nicole Pfarr 表示：“ 我们期待在未来的实验室项目中，将这一检测纳入常规。通过将HRD检测与 TruSight Oncology 500 结合在一个工作流程中，即可了解肿瘤基因组的全貌，同时保持实验室的分析效率。”大型队列研究表明，全景变异分析（CGP）可在多达 90% 的样本中发现相关变异。与多次、反复检测相比，单次、全面检测可以使用更少的样本来评估多种生物标志物，返回结果也更快。作为试剂盒化、可商业化分发的解决方案，该方法有助于消除 CGP 和 HRD 检测在内部开展的障碍，以便各种规模的实验室都可以开展此项功能强大的检测。默沙东研究实验室临床肿瘤学早期开发高级副总裁 Eric H.Rubin 博士表示：“我们很高兴与因美纳一起达到这一里程碑，将用于 HRD 评估的检测方法商业化，助力临床研究的发展并拓展临床试验的可及性。”这项科研检测预计将于今年8 月开始在全球（不包括美国和日本）发行。此外，因美纳与默沙东于2021 年 9 月宣布的合作内容之一，即正在为欧盟和英国市场开发一款全新的 HRD 伴随诊断（CDx）检测产品，将帮助识别 HRD 状态呈阳性的卵巢癌患者。 此次与默沙东的合作，扩展了因美纳与肿瘤学行业领军企业的广泛的合作伙伴关系，共同推动癌症诊断和精准医疗的发展。 关于 TruSight Oncology 500TSO 500 是一种仅供研究使用的泛癌种检测，可实现全景变异分析。TSO 500 旨在识别 523 个基因中已知和未知的肿瘤生物标志物，利用肿瘤样本中的 DNA 和 RNA 鉴定对癌症发展和进展至关重要的关键变异，例如小 DNA 变异、融合和剪接变异。此外，该检测还评估关键免疫肿瘤生物标志物，如肿瘤突变负荷（TMB）、微卫星不稳定性（MSI）和同源重组修复缺陷（HRD）。该检测可获取全面的生物标志物，因此实验室可以将多个单基因或小panel 的工作流程整合至单个检测中，节省活检样本和时间。精彩会议预告点击图片免费报名参加“第五届基因测序网络大会”

仪器信息网讯 厦门大学颜晓梅教授团队于2014年9月研制成功第一台纳米流式检测仪原型机，2015年10月第四代原型机研制成功，2016年1月中旬在北京计量科学研究院进行第一次试用，2016年6月第一代科研级纳米流式检测仪完美亮相CYTO 2016国际流式学术大会，2016年10月专业版软件NF Profession 1.0研发成功。纳米流式技术发展处于什么阶段？纳米流式技术成果商业化过程有哪些故事？国产仪器自主创新存在哪些痛点和不足？近期，仪器信息网在ACCSI2021现场特别采访了厦门大学颜晓梅教授，请她就上述问题进行了分享。三年实现快速成果转化，粒径表征媲美透射电镜目前，流式细胞仪在生命科学、临床医学等领域是重要的分析检测工具之一。据颜晓梅教授介绍，纳米流式检测技术是基于流式细胞技术，将检测下限推进到纳米尺度。颜晓梅教授团队首创性地结合瑞利散射和鞘流单分子荧光检测技术，研发成功具有自主知识产权的纳米流式检测技术，实现单个纳米颗粒（7-500 nm）以及外泌体、病毒、细菌、亚细胞器等天然生物纳米颗粒的粒径及其分布、颗粒浓度、和生物化学性状的高通量多参数同时表征。该技术的粒径表征分辨率媲美透射电镜，检测速率高达每分钟上万个颗粒，同时兼备电子显微镜难以实现的生物化学性状分析功能，填补了国际空白。项目团队积极推进技术产业化，成立了厦门福流生物科技有限公司，仅用3年时间就将“纳米流式检测技术”研发成果转化为“中国智造”。 厦门福流生物 纳米流式检测仪点击查看参数详情科学仪器研发平台离不开交叉学科人才培养在采访中，颜晓梅教授强调了复合型科研人才的培养对于国产科学仪器的发展至关重要，科学仪器研制的过程通常是创新技术密集（光、声、电等技术）、管理复杂的活动，需要不同学科的交叉融合，尤其成果转化过程也需要金融、市场等背景支持。因此培养兼具科研、工程和管理能力的复合型人才对于国产科学仪器成果转化具有推动作用。提高纳米医药业核心竞争力，纳米流式未来可期据颜晓梅教授介绍，纳米流式检测技术不仅应用于传统的生命科学、临床医学领域，还在食品药品安全以及能源材料等领域发挥重要作用。并且纳米流式检测仪产业化项目技术密集、附加值高、成长空间大、带动作用强，是纳米医药业核心竞争力的集中体现。 据悉，厦门福流生物科技有限公司生产的纳米流式检测仪目前已经出口到全球顶尖的医疗机构、科研单位和高科技企业，如梅奥诊所（Mayo Clinic，2018年全美排名榜首的医院）、美国德州大学安德森癌症中心（MD Anderson Cancer Center，全球排名第一的肿瘤科研与临床研究机构）、约翰霍普金斯医学院、美国国立卫生研究院（NIH）、外泌体诊断和治疗应用开发领军企业Codiak Biosciences公司、瑞士联邦理工学院（欧陆第一理工大学）、诺和诺德（世界领先的生物制药公司）、瑞典哥德堡大学、德国马尔堡大学、悉尼大学、台湾大学、复旦大学等。

融合化学创新的生物制造，是可持续生物经济发展的原动力，也是当前中美科技博弈的焦点之一。生物制造的关键“芯片”是酶，然而现有酶的催化功能有限等问题极大地限制了生物制造的范畴。南京大学黄小强课题组自2021年建组以来，致力于融合生物与化学，实现新酶元件的创制和新分子生化体系的开发。近期，黄小强课题组与合作者以烯烃还原酶（ene-reductases, ER）为切入点，开发了可见光直接激发的新策略，实现了一例烯烃的不对称自由基氢芳基化转化。相关工作发表于Nature Catalysis。将酶催化和光催化结合的光酶催化，融合了可见光化学多样的反应性和酶的高选择性，成为当下开发新酶功能最有效的策略之一。ER是一类以黄素腺嘌呤单核苷酸（FMN）为辅因子的氧化还原酶，在自然界中催化C=C双键的双电子还原反应。前期Hyster、Huimin Zhao、吴起和徐鉴等课题组，通过可见光激发电子供体-受体（EDA）络合物的策略，开发了一系列净还原的自由基反应（图1b）。然而，直接可见光激发黄素蛋白催化非天然的双分子反应仍未有报道。图1. 受自然启发的光酶的氢芳基化。图片来源：Nat. Catal.除了光引发的自由基反应固有的选择性控制难题外，激发态的黄素蛋白面临很多竞争途径。首先，可见光激发的醌态黄素容易被反应缓冲液或氨基酸残基还原（图2，路径b）。其次，自由基碳碳成键步骤必须足够高效，以实现与无效的电子回转的竞争（图2，路径c）。第三，溶液中游离的未结合黄素可能引起消旋背景反应。受自然界中黄素依赖的脂肪酸光脱羧酶的启发，作者提出了一种直接光激发烯烃还原酶的新催化循环（图2）。首先，ER结合的辅因子FMNox被蓝色LED激发，由基态到达激发态FMNox*（Int. B）。激发态FMNox*单电子氧化富电子芳烃产生芳基自由基阳离子中间体以及半醌状态黄素辅因子FMNsq（Int. C）。随后的自由基C-C键形成，生成前手性自由基中间体（Int. D）。最后，酶活性位点内的电子和质子（或氢原子）转移，生成对映体富集的产物，并再生FMNox（Int. E）。图2. 设计的催化循环。图片来源：Nat. Catal.为了验证所设计的生物催化循环方案，作者选择了3-甲氧基噻吩1a和α-甲基苯乙烯2a作为模板底物，450-460 nm蓝色LED光照，发现几类烯还原酶可以以较低的反应性实现催化加氢芳基化（表1）。进一步研究发现，通过额外加入催化量的FMN作为添加剂，能够显著提高反应收率而不影响对映异构体选择性。通过条件优化，作者筛选到的葡萄糖酸杆菌来源的烯还原酶（GluER）可以实现对模板反应的高产率、高选择性催化，产物具有 (R) 选择性（97.5：2.5 er，entry 5）；而来自酿酒酵母的老黄酶（OYE1）的产率为60%，具有 (S) 选择性（90：10 er，entry 6）。对以老黄酶为母本的突变体进行筛选，发现老黄酶的突变体（OYE1-F296A）的产率为65%，具有更好的 (S) 选择性（95：5 er，entry 7）。控制实验表明，惰性气氛、光照、酶都是反应正常进行所必需的。同时，降低酶催化剂的负载量到0.2 mol%，也能有52%的中等收率和优异的 (R) 选择性（95：5 er，entry 11）。表1. 条件优化。图片来源：Nat. Catal.接下来，作者使用GluER（ER1）、GluER_T36A-Y177F（ER2）、OYE1_F296A（ER3）、OYE1_F296G（ER4）对底物的适用性进行了考察（图3）。总体来看，该催化体系具有良好的底物适用范围和官能团耐受性，活化烯烃、内烯烃、非活化烯烃、以及各类芳基底物，都能顺利发生反应（27例，最高达99%收率）。通过使用不同的酶，该体系能够分别获得产物的两个对映异构体，即实现立体发散式生物合成。同时，反应可以以相同的效率和对映选择性放大到1 mmol级，如 (R)-3a的合成所示。此外，单晶X射线衍射研究确认ER3-4催化的产物的绝对构型为 (S)。图3. 代表性底物。图片来源：Nat. Catal.随后，作者进行了一系列的机理研究来验证所提出的催化反应机理。1）紫外-可见吸收光谱鉴定可见光直接激发FMN的关键过程（图4a）；2）低温电子顺磁共振（EPR）实验和自由基捕获实验证实了该反应涉及的相关自由基中间体；3）自由基开环实验验证生成的自由基中间体，证实了Int. D的存在（图4d）；4）氘代实验探索了自由基终止步骤的氢来源（图4e）。图4. 机理实验。图片来源：Nat. Catal.为了更好地理解关键的光氧化机制，作者进行了含时密度泛函理论（TDDFT）计算。计算结果显示，从1a到激发态FMNox*的单电子转移放热2.3 kcal/mol（图5a），支持可见光引发的单电子氧化在热力学上是有利的。作者为了研究OYE1_F296G中自由基反应过程的对映体选择性（Int. C → Int. E），进行了经典的MD模拟、QM/MM MD模拟和QM/MM计算，模拟结果支持自由基阳离子加成→质子转移→氢原子转移这个反应途径（图5c）。有趣的是，Int. C中的底物2a可以采用两种不同的构象，CH3基团可以朝里的，也可以是朝外的（图5b）。2a通过甲基（CH3-in → CH3-out）的翻转而发生的构象变化在动力学上非常容易，具有2.1 kcal/mol的较小能垒。从Int. C开始，QM/MM计算表明，对于CH3-in构象，1a+和2a之间的C-C耦合的能垒为15.6 kcal/mol，而CH3-out构象的能垒为12.7 kcal/mol，表明CH3-out构象更适合C-C偶联。这主要是因为2a的双键在CH3-out构象（3.75 Å）中与1a+-C2保持的距离比在CH3-in构象（4.17 Å）中更近。从IM1开始，计算表明阴离子FMNsq的N5可以作为从噻吩基C2位点提取质子的碱，CH3-in构象质子转移的能垒为12.9 kcal/mol，在CH3-out构象中，这一步反应能垒为13.5 kcal/mol。最后，前手性碳自由基可以从中性FMNsq物种中发生氢原子提取（HAT），分别从Int. D（CH3-in）得到 (R)-3a，从Int. D（CH3-out）得到 (S)-3a。图5c表明，对映选择性主要由1a+和2a之间的C-C偶联步骤决定。由于OYE1_F296G活性位点对底物的定位，(S)-3a的形成在动力学上优于(R)-3a，这与OYE1突变体形成的产物绝对构型一致。而对GluER催化反应的进一步计算表明，立体选择性也主要由C-C偶联步骤决定。图5. OYE1_F296G催化加氢芳基化的计算研究。图片来源：Nat. Catal.总之，南大/厦大/中科大团队合作报道了一例可见光直接激发黄素蛋白实现烯烃的不对称自由基加氢芳化反应，以优异的产率（最高达99%）和对映选择性（最高达99:1 er）制备了一系列对映体富集的氢芳基化产物。与先前报道的基于烯烃还原酶的光酶催化净还原体系不同，本文发展了一种机理上独特的氧化还原中性的催化循环，关键步骤是可见光直接激发黄素蛋白，并引发后续的单电子氧化和自由基加成途径。本文的理论计算部分由厦门大学王斌举课题组完成，电子顺磁共振实验部分由中国科学技术大学生命科学学院/中国科学院强磁场科学中心田长麟课题组完成，其余部分由南京大学黄小强课题组完成。南京大学博士研究生赵贝贝、厦门大学博士研究生冯键强和中国科学院强磁场科学中心于璐副研究员为论文的共同第一作者。黄小强特聘研究员、王斌举教授和田长麟教授为论文的共同通讯作者。论文得到了南京大学启动经费、科技部重点研发计划（2022YFA0913000, 2019YFA0405600, 2019YFA0706900）、国家自然科学基金（22277053, 22121001, 21927814, 21825703）、江苏省自然科学基金（BK20220760）、中国科学院青促会（2022455）等项目，以及稳态强磁场实验装置（SHMFF）的支持。原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：Direct visible-light-excited flavoproteins for redox-neutral asymmetric radical hydroarylationBeibei Zhao, Jianqiang Feng, Lu Yu, Zhongqiu Xing, Bin Chen, Aokun Liu, Fulu Liu, Fengming Shi, Yue Zhao, Changlin Tian, Binju Wang & Xiaoqiang HuangNat Catal., 2023, DOI: 10.1038/s41929-023-01024-0通讯作者简介黄小强博士，南京大学化学化工学院特聘研究员、国家青年人才（海外）、重点研发计划青年首席；已在Nature, Nat. Catal.(3), Nat. Commun., JACS (3), ACIE (2), Acc. Chem. Res.(2)等杂志发表一作/通讯论文多篇。实验室正在招聘生物合成和化学合成方向的博士后、博士研究生，详见课题组主页：https://www.x-mol.com/groups/huang_xiaoqiang