肌动蛋白

大家好，本周为大家分享一篇发表在Nat. Commun.上的文章：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics ，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。　　蛋白质大多都是通过组装成蛋白复合物来执行特定的生物功能，因而表征内源性蛋白复合物的结构和动力学将有助于生命过程的理解。蛋白复合物在其组装、翻译后修饰(Post-translational modifications，PTMs)和非共价结合等方面是高度动态的，在native状态下通常以低丰度存在，这给研究其结构和动态性的传统结构生物学技术(如X-ray和NMR)带来了巨大的挑战。非变性Top-down质谱(nTDMS)结合了非变性质谱和Top-down蛋白组学的优势，目前已发展成蛋白复合物结构表征的有力工具，可以保留蛋白质亚基-配体间的非共价作用和PTMs等重要信息。然而，由于内源性蛋白复合物自身的低丰度特性，导致对其的分离纯化和检测非常困难，所以nTDMS目前仅限用于过表达的重组或高丰度蛋白质的表征。在本研究中，作者开发了一种非变性纳米蛋白质组学(Native nanoproteomics)技术平台，通过使用表面功能化的超顺磁性纳米颗粒(Nanoparticles，NPs)直接富集组织中的蛋白复合物，然后再利用高分辨质谱表征其结构和动态性。这里选用心肌肌钙蛋白(Cardiac troponin，cTn)异源三聚体复合物(~77 kDa)作为研究对象。cTn三聚体复合物是调节横纹肌肌动蛋白收缩的Ca2+离子调节蛋白，由TnC、cTnI和cTnT这3个亚基组成。其中，TnC是Ca2+结合亚基，cTnI是抑制肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的亚基，而cTnT细丝锚定亚基。TnC与Ca2+的结合，以及cTnI 亚基的磷酸化，会共同引起细丝上的分子级联事件，诱导心肌收缩所必需的肌动蛋白-肌球蛋白交叉桥的形成。传统结构生物学技术不能有效捕获cTn复合物高度动态的构象变化，并且先前研究用的cTn复合物是由原核细胞表达的，缺乏PTMs的信息。因此，作者开发了native纳米蛋白组学的方法，以实现对人内源性cTn复合物结构和动力学的全面表征。作者首先使用肽功能化的超顺磁性氧化铁NPs富集了人心脏的内源性cTn复合物，同时优化了非变性蛋白提取缓冲液(高离子强度LiCl溶液，生理pH)。富集到的cTn复合物中的3种亚基的含量比例为1:1:1，真实反应了肌节cTn异源三聚体复合物的组成。作者也发现含有750 mM L-Arg，750 mM咪唑和50 mM L-Glu(pH 7.5)的溶液对蛋白复合物的洗脱效果最好，并且不会破坏亚基间的相互作用。该富集方法具有很好的重现性，proteoforms信息得到很好保留，且可以直接用于化学计量分析。总的实验流程如图1所示，洗脱后的cTn复合物经体积排阻色谱(Sze-exclusion chromatography，SEC)除盐和交换至醋酸铵溶液中，随后对cTn复合物进行多种nTDMS分析：1)在线SEC监测复合物 2)超高分辨傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR-MS)表征复合物的化学计量比和proteoforms 3)捕获离子淌度质谱(TIMS-MS)解析调控复合物构象变化中的非共价作用的结构动态性。　　图1. 用于表征人心脏中内源性cTn复合物的native纳米蛋白组学平台。　　为了全面表征内源性cTn复合物，作者使用FTICR-MS进行proteoforms测序和复合物表征。图2展示了native状态下检测丰度最高的cTn复合物的电荷态(19+)，其中包含了4种独特的proteoforms，这些复合物主要带有单磷酸化的cTnT、单磷酸化和双磷酸化的cTnI，以及结合了3个Ca2+的TnC。这些结果表明人cTn复合物在肌节中以结构多样化的分子组成存在，具有高度异质的共价和非共价修饰，可产生一系列不同的完整复合物。　　图2. FTICR-MS分析展示的cTn复合物状态。红色方框中是最高丰度电荷态(19+)的放大谱图，理论同位素分布(红色圆圈)可以与谱图很好叠加，说明结果具有高质量精度(质量偏差在2 ppm 以内)。　　作者接着对cTn复合物进行complex-up分析，以研究复合物的化学计量比及其组成。图3a~3b分别显示的是完整cTn三聚体复合物，以及经CAD碎裂后的蛋白亚基谱图。但这里没有检测到cTnI单体，可能是因为cTnI和TnC在native状态下的亲和力很强，且cTnI单体带的电荷不多，导致其在高m/z区域出峰，所以不易被检测到.随后，作者又对解离出的亚基进行complex-down分析。图3c展示了检测到的cTnT的多种proteoforms：未磷酸化的 cTnT、单磷酸化的cTnT(p cTnT)和 C 端 Lys 截断的磷酸化cTnT(pcTnT [aa 1-286])，CAD碎裂谱图也发现cTnT的C端较N端更易暴露在外界溶剂中。图3e则是cTn(I-C)二聚体的谱图，共检测到6种具有不同数量Ca2+结合和磷酸化的proteoforms。二级谱图可将cTnI的两个磷酸化位点准确定位在Ser22和Ser23，同时发现cTnI序列两端都较内部区域更易暴露于溶剂中。但还无法通过nTDMS准确推断Ca2+结合和磷酸化是如何影响cTn复合物的稳定性。作者在此也没有优化FTICR-MS在非常高m/z范围的离子检测，所以也会遗漏带少量电荷的cTn复合物信息。　　图3.nTDMS表征人心脏来源的cTn复合物。(a~b)完整cTn复合物和经CAD碎裂后的亚基谱图 (c~d)cTnT单体及其代表性的CAD碎裂谱图 (e~f)cTn(I-C)二聚体及其代表性的CAD碎裂谱图。　　人TnC蛋白含有3个钙结合EF-hand基序(结构域 II~IV)。结构域 II与Ca2+结合的亲和力较低，是触发心肌收缩的调控域。结构域 III 和 IV则与Ca2+具有强的亲和力，在心肌舒张和收缩时均始终保持与Ca2+充分结合，但结构域 II只有在收缩时才被Ca2+占据。这里观察到了TnC分别与0、1、2和3个Ca2+结合的情况，通过CAD碎裂也进一步定位了TnC与Ca2+结合的具体氨基酸序列(图4)。研究发现结构域 II的骨架最容易发生碎裂，而结构域 III的骨架最难碎裂。目前结构域 II~IV的序列在UniprotKb中分别对应65DEDGSGTVDFDE76、105DKNADGYIDLDE116和141DKNNDGRIDY152。这里分别将与1、2和3个Ca2+结合的TnC隔离出来进行CAD碎裂(m/z分别为2312、2316和2321)，可以更准确地将结构域 III、II和IV的序列分别定位到113DLD115、141DKNND145和73DFDE76(图4c)，表明非变性纳米蛋白组学方法在定位非共价金属结合方面具有高分辨能力。　　图4.nTDMS定位 TnC与Ca2+结合的结构域。(a)FTICR-MS隔离与不同数量Ca2+结合的TnC单体 (b~c)与两个Ca2+结合的TnC的CAD碎裂谱图，蓝色、红色和黄色方框分别对应结构域 II 、III和IV。　　Ca2+与TnC的结合会对cTn复合物的功能和构象有着很大影响。cTn复合物的核心区维持着构象的稳定，但当Ca2+与TnC发生结合时，其柔性区会经历广泛的构象变化，复合物结构会从“closed”状态转变成“opened”状态，这会促进肌动蛋白和肌球蛋白间的相互作用，最终导致心肌收缩。然而，传统结构生物学技术很难捕获cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化。因此，作者使用离子淌度质谱来分析cTn复合物的构象变化。TnC亚基和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体的淌度分离谱图如图5所示。与0~3个Ca2+结合的TnC的碰撞截面(Collision Cross-Section，CCS)值分别为1853、1849、1829和1844 Å2(图5a~5b)，TnC构象比IMPACT预测的更为紧凑，但cTn(I-C)二聚体的CCS值与预测的非常接近(图5c~5d)。作者推测TnC与两个Ca2+结合会形成更致密的构象，是因为在静息舒张时Ca2+与结构域 III 和 IV充分结合。当第三个 Ca2+与结构域II结合时，TnC转变为“opened”构象，使其N端与cTnI的C端相结合，进而引发心肌收缩(图5e)。cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化也是如此(图5f)。　　图5.TnC单体(a~b)和与Ca2+结合的cTn(I-C)二聚体(c~d)的离子淌度分离谱图 (e~f)TnC和cTn(I-C)二聚体与Ca2+结合时的构象变化。　　最后，作者通过添加EGTA来剥离cTn复合物中的Ca2+，以进一步研究Ca2+在维持复合物结构稳定性上的作用。图6b~6c是没有EGTA孵育时的cTn复合物的TIMS-MS谱图。cTn复合物的CCS值与理论预测值非常符合。随着EGTA孵育浓度的增加(25、50和100mM)，Ca2+逐渐被螯合，cTn复合物的结构也越来越舒展，体现在平均电荷态逐渐增加，以及逐渐在较低m/z范围内出峰，这表明cTn复合物构象的稳定性丢失与EGTA浓度的增加相关(图6d~6f)。虽然100mM EGTA孵育也不敢保证Ca2+的完全剥离，并且cTnI的存在又会增强TnC与Ca2+的结合，但TIMS-MS为我们研究cTn复合物与Ca2+结合时的构象变化提供了一种切实可行的分析手段。　　图6.cTn复合物与EGTA孵育时的构象变化。(a)cTn复合物的构象随EGTA孵育浓度的增加发生改变 (b~c)cTn复合物的TIMS-MS谱图 (d~f)cTn复合物与不同浓度EGTA(25、50和100mM)孵育的谱图和CCS分析。　　总的来说，本研究开发了一种可用于内源性蛋白复合物富集和结构表征的非变性纳米蛋白组学方法，以获取其组装、proteoforms异质性和动态非共价结合等方面的生物信息。本文采用的功能化NPs可被灵活设计成选择性结合特定的靶蛋白，在富集和洗脱过程中可以很好保持其近似生理条件下的存在状态。更为重要的是，功能化NPs与nTDMS的整合可以作为一种强有力的结构生物学工具，可以作为传统技术的补充，用于内源性蛋白复合物的表征。　　撰稿：陈昌明 编辑：李惠琳文章引用：Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics　　参考文献　　Chapman EA,Roberts DS, Tiambeng TN, et al. Structure and dynamics of endogenous cardiac troponin complex in human heart tissue captured by native nanoproteomics. Nat Commun. 2023 14(1):8400. Published 2023 Dec 18. doi:10.1038/s41467-023-43321-z

蛋白组学是当今生命科学和精准医学的研究热点，目前仍处于早期快速发展阶段。其发展轨迹与早期的基因组学相似，随着时间的推移，蛋白组学在研究和临床中的应用潜力将逐渐释放，有望接近基因组学的市场规模。当前，全球蛋白组学市场规模已达500亿美元，且呈现快速增长趋势。随着资本市场的关注，不断有新公司进入并获得融资，推动了新技术的不断涌现。 蛋白组学技术的扩展与应用 蛋白质组学技术已从最初的蛋白质定性鉴定扩展至多个领域，包括蛋白质定量表达分析、翻译后修饰鉴定和定量、蛋白质互作分析、蛋白质复合物成分解析、空间蛋白质组分析以及单细胞蛋白质组分析。这些技术不仅应用于基础科学研究，更在药物开发、临床医学和转化医学等领域展现出巨大潜力。这一切得益于质谱技术、蛋白质分离技术、生物化学技术和计算机技术的快速发展。 质谱技术：蛋白组学发展的关键 质谱技术是推动蛋白质组学发展的关键技术，特别是在生物标志物发现方面具有黄金标准地位。在全球范围内，只有少数制造商发明了能够区分小至单肽分子的复杂质谱技术，包括布鲁克公司（Bruker）、赛默飞公司（Thermo Fisher Scientific）、安捷伦公司（Agilent）、沃特世公司（Waters）和 Sciex 公司。其中，赛默飞世尔公司在蛋白组学研究质谱市场中拥有超过90%的市场份额，主要归功于其创新的Orbitrap系列。布鲁克公司的TimsTOF系列则是蛋白组学领域增长最快的质谱之一，从赛默飞公司那里获得了市场份额，以约30%的速度增长。质谱技术的持续创新将对蛋白组学的发展产生深远影响。然而，质谱技术的标准化和应用流程的复杂性，尤其是样品制备阶段的缺乏标准化，成为其进一步推广的瓶颈。正是在这一背景下，像Evosep等公司在液相色谱标准化方面取得了突破，逐步占据了60%以上的市场份额。这种创新反映了市场对流程效率提升的迫切需求。与此同时，新兴技术如Seer、Olink和Somalogic通过纳米粒子分离技术和适配体蛋白质检测技术，正在改变传统的蛋白质组学检测方式，显著提高了检测精度和通量。 蛋白组学的产业链 蛋白组学市场已形成涵盖上游质谱仪器和蛋白质组学试剂供应商、中游蛋白组学技术服务公司以及下游蛋白组学终端客户的完整产业链条： 颠覆性技术与企业的崛起 近年来，Seer、Olink、Somalogic、Nautilus和Quantum-Si等企业凭借其颠覆性技术，改变了传统的蛋白组学检测方式，极大地提升了检测的通量、准确性、特异性和敏感性：&bull Seer：发明了一种在液相色谱分离之前对蛋白质进行标准化消化和分离的工作流程。其专有的纳米粒子技术将蛋白质分成4组，增强了低丰度蛋白质的检测。&bull Olink：通过DNA编码连接到蛋白质上，实现蛋白质定量可通过基因测序的基础设施进行。其PEA（临位延伸分析）检测技术在qPCR仪器或Illumina的下一代测序仪上工作，提供高通量和特异性。&bull Somalogic：利用适配体进行蛋白质检测，其SomaScan平台可以识别并检测大量的蛋白质。该公司拥有一个由7000个独特适配体组成的文库，能够在48小时内从单个样品中识别7000种不同的蛋白质。&bull Nautilus：其技术利用专有仪器、流动池和试剂，对样品中95%的蛋白质组进行量化。设计了一个"超密集单分子蛋白质纳米阵列"，实现了单分子分辨率。 国内市场的快速发展 在蛋白组学行业，欧美企业布局早，经过多年发展成熟后逐渐得到资本市场认可。包括Seer、Olink、Nautilius、Quantum-Si以及Somalogic在内的多家生物科技公司从2020年开始陆续上市。Seer、Olink、Somalogic是欧美三家蛋白质组学的标杆企业，Seer是其中最年轻的公司，但是为下一代蛋白质组学带来了创新技术和路径。与之相比，国内企业起步较晚，但发展迅速。景杰生物、中科新生命等专注于蛋白组学，而诺禾致源、华大基因、美吉生物、欧易生物等企业也同时提供蛋白组学服务。国内市场规模从2016年的1.2亿元增长到2020年的5.8亿元，年复合增长率高达49.1%，预计2025年将达到22.6亿元。（摘自弗若斯特沙利文分析）与此同时，随着精准医学和转化医学的快速发展，越来越多新发现蛋白质生物标志物的检测工作，将为蛋白质组分析带来巨大的市场需求。我们发现抗体-药物偶联物（ADC）药物正在快速发展，其结合了单克隆抗体的靶向能力和细胞毒性药物的强效性，成为癌症治疗领域的突破性疗法。在ADC药物的研发过程中，蛋白组学起到了至关重要的作用。（点击查看→ADC药物如何精准制导癌症治疗、质谱如何推进ADC药物研发）蛋白组学技术可用于鉴定和验证ADC的靶标蛋白，帮助研究人员筛选出最具潜力的治疗靶点。此外，蛋白组学在分析抗体与抗原的结合位点、优化抗体结构以提高药物效力和降低副作用方面也具有重要价值。总而言之，蛋白组学还是处于发展的黄金时代，质谱技术的不断进步将推动着整个行业的快速前进。随着多组学整合、人工智能赋能、空间蛋白质组学兴起和临床应用加速落地等趋势的出现，蛋白组学将在生命科学、精准医学和药物研发等领域发挥越来越重要的作用。在全球蛋白质组学有着千亿美元市场的机遇下，就需要加强核心技术研发，尤其是在质谱、单细胞和空间蛋白质组学等领域实现突破。同时，积极推动多组学整合，结合基因组学、代谢组学等数据，构建全面的生物学信息网络，深化对复杂疾病的理解。此外，深化国际合作与交流，吸收全球先进技术和经验，增强自身的创新能力，参与全球市场竞争，提升国际影响力。通过这些努力，中国企业将有望在全球蛋白组学市场中分得一杯羹，为生命科学和精准医学的发展做出更大贡献。

研究背景：　　FERM结构域的蛋白家族中，黏着斑蛋白（kindlin）和踝蛋白（talin） 是进化上高度保守并且在FERM结构域中表现出高度同源性。kindlin家族在整合素（integrin）活化中发挥重要作用，参与integrin的双向信号传导，对整合素受体介导的细胞与细胞外基质的黏附、细胞-细胞外基质的黏附、细胞迁移、胚胎发育、损伤修复等过程中发挥关键作用。此外kindlin的异常还可以导致多种遗传性疾病的发生，同时kindlin家族作为重要的信号分子还参与了肿瘤的发生发展过程。　　近日，《Nature Communications》刊登了Grégory Giannone等学者的最新研究成果，该团队使用Abbelight 3D单分子超分辨成像系统SAFe 360的超分辨-单分子追踪技术（SPT-PALM）研究了kindlin和talin等蛋白在细胞质膜中的扩散机制。　　研究内容：　　焦点黏着斑蛋白（FAs）家族广泛参与整合素依赖型细胞粘附、极性和迁移等过程，通过直接或间接的方式结合在细胞外基质（ECM）和肌动蛋白细胞骨架之间，并与具有不同结构、信号或支架功能的蛋白建立物理联系。然而FAs蛋白如何被引导到特定的纳米层以促进与特定靶点的相互机制目前尚不清楚。为探究其机制，Grégory Giannone等将kindlin的蛋白分子行为和3D纳米级定位与其在FAs内integrin激活中的功能联系起来，通过单蛋白追踪、超分辨成像以及功能分析kindlin在上膜的定位和扩散对integrin激活、细胞扩散和FAs形成过程，并通过研究发现kindlin通过与talin不同的途径来达到和激活integrin，为integrin激活期间的互补性提供了可能的分子基础。　　首先，作者通过追踪integrin在细胞中不同区域的单分子运动轨迹，计算单个β1-integrin或者β3-integrin分子的扩散系数，并比较integrin在FA内和FA外的扩散系数，发现integrin在FA中有自由扩散（绿色轨迹），被束缚的区域扩散（黄色轨迹）和固定不动三种不同模式。不同的细胞中，integrin在FA外普遍表现出更快的扩散速度，更多倾向于纯自由扩散。同时Mn2+的处理会让更多的integrin分子倾向于固定不动，也即参与同kindlin和或talin相互作用。经过计算kindlin突变体和talin突变体中β1-integrin或者β3-integrin的扩散系数并比较，发现对于这两个突变体，Mn2+处理结果略有不同，kindlin突变体中integrin分子倾向于固定不动的比例相对于talin突变体较低一些。integrin，kindlin和talin在细胞中的扩散的轨迹分布于扩散系数分布　　为了进一步分析kindlin和talin与integrin相互作用的机制，观测比较kindlin和talin单分子扩散轨迹可发现integrin和kindlin通过细胞膜自由扩散独立进入焦点黏着斑（FAs），而talin和paxillin通过胞浆自由扩散到达FAs。在FAs中integrin展现自由扩散和被束缚的扩散两种扩散模式，两种模式都是通过kindlin和talin的结合触发。自由扩散时integrin，kindlin和talin同时以正确的取向结合的概率非常低，Grégory Giannone等学者研究显示三者更倾向于如上图所示的模型，也即在质膜上自由扩散的integrin和kindlin会先形成不可移动的integrin-kindlin复合物(i)；这种复合物可以限制整合素β端的方向，并有利于talin与近端NPxY基序的结合，从而形成短暂integrin-kindlin-talin的三元复合物(ii)；kindlin可以间歇性地解离(iii)并再次(ii)与寿命更长的integrin-talin复合物重新结合。这种瞬态的integrin-kindlin-talin三元复合物的相互作用会大大延长integrin和talin的相互作用的持续时间。talin和kindlin脱附后integrin会继续恢复自由扩散的模式，直至再次和kindlin结合。kindlin和talin激活整合素的示意图模型　　实验设备简介：　　本实验中实用的单分子示踪系统是abbelight公司研发的3D单分子定位显微系统—SAFe 360，利用其特有的DAISY技术将xyz方向的定位精度提高至15 nm，可以精确观测蛋白颗粒的定位分布及其运动轨迹。除此之外，该设备还具备大视场和一键式操作，能够大幅度降低单分子定位操作技术的门槛，帮助研究者从事分子机制的研究。　　典型采集实例：神经元超分辨成像大肠杆菌线粒体三维结构外泌体成像　　参考文献：　　[1] Orré, Thomas, et al. "Molecular motion and tridimensional nanoscale localization of kindlin control integrin activation in focal adhesions." Nature communications12.1 (2021): 1-17.