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[color=#444444]先已合成的生物素的中间体:双苄基生物素和双苄烯生物素的液相色谱峰重叠,有何办法能将两峰分开。[/color][color=#444444]采用的色谱条件是:C18柱,流动相是磷酸盐缓冲溶液:乙腈=60:40,流速1ml/min, 波长210 nm[/color]
[font=宋体][font=宋体]生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]亲和素系统 [/font][font=Calibri](biotin-avidin system[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]BAS)[/font][font=宋体],是[/font][font=Calibri]70[/font][font=宋体]年代后期应用于免疫学,并得到迅速发展的一种常用的生物反应放大系统。它具有高度特异性、敏感性、稳定性的特点,两者的亲和常数([/font][font=Calibri]K=1015 mol/L[/font][font=宋体])比抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体([/font][font=Calibri]K=105[/font][font=宋体]~[/font][font=Calibri]1011 mol/L[/font][font=宋体])至少高[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]万倍,是目前已知强度最高的非共价作用,这使得生物素标记的蛋白成为研究蛋白质相互作用和筛选抗体或小分子潜力药物的强大工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州开发了丰富的生物素标记蛋白产品,拥有[/font][font=Calibri]Avi-tag[/font][font=宋体]定点标记和化学标记两种类型的生物素标记蛋白,覆盖细胞治疗、抗体药、疫苗等热门靶点。产品具有高批间一致性、高活性等优势,适用于[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Biopanning[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]SPR / BLI[/font][font=宋体]等实验。下面为大家提供生物素蛋白标记常见问题及注意事项:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]生物素蛋白标记常见问题:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、什么是生物素标记蛋白[/font][font=Calibri]?[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在生物化学中,生物素化蛋白质就是生物素与蛋白质等大分子物质共价结合的产物。生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]亲和素亲和常数至少比抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体高一万倍[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]是目前发现的自然界中具有最强亲和力的物质。因此,生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]亲和素系统已被广泛地应用于免疫诊断技术。生物素化蛋白的出现,也为类似于[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]实验简化了流程,提高了效率。此外,由于生物素的小尺寸([/font][font=Calibri]MW = 244.31g / mol[/font][font=宋体]),不太影响蛋白质本身的天然功能。所以它同时具备了高亲和力、高特异性、高灵敏度的优点。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、生物素标记蛋白有哪些应用?[/font][/font][font=宋体][font=宋体]生物素标记蛋白广泛的应用在生物技术的众多领域。如透析,将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中,当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时,与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附,直接流出,从而与被分离的蛋白质分开,然后选用适当的洗脱液,[/font] [font=宋体]改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。怎么释放所需蛋白呢?这需要非常严苛的条件(例如,[/font][font=Calibri]pH=1.5[/font][font=宋体]的 [/font][font=Calibri]GuHCl[/font][font=宋体]),这种极端条件下的蛋白是会变性的。如果需要分离标记的蛋白质,最好用亚氨基生物素标记的蛋白质。该种生物素在碱性条件下与抗生物素蛋白结合紧密,但是在降低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]以后,亲和力降低。因此亚氨基生物素标记蛋白可以通过降低[/font][font=Calibri]pH([/font][font=宋体]约[/font][font=Calibri]pH=4)[/font][font=宋体]从柱子上释放。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫检测中的应用:在常规[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]原理的基础上,结合生物素[/font][font=Calibri](B)[/font][font=宋体]与亲和素[/font][font=Calibri](A)[/font][font=宋体]间的高度放大作用,而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如抗体等[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]以共价键结合。这样,结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]或抗体[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]分子的目的。 这可以用于通过荧光或电子显微镜定位的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]测定,[/font][font=Calibri]ELISPOT[/font][font=宋体]测定,[/font][font=Calibri]western[/font][font=宋体]印迹和其他免疫分析方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]生物素标记注意事项:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类(氨基、醛基或巯基)以及分子的酸碱性,选择相应的活化生物素和反应条件;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、标记反应时,活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例;生物素:[/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]用量比[/font][font=Calibri](mg/mg)[/font][font=宋体]宜为[/font][font=Calibri]2:1, IgG[/font][font=宋体]应用浓度[/font][font=Calibri]0.5~5[/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/ml [/font][font=宋体]生物素[/font][font=Calibri]1~3[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/Ag[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]3~5[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/Ab[/font][font=宋体];[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、为减少空间位阻影响,可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后,不影响后者的免疫活性;标记酶时则结果有不同。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/category/biotinylated-protein-elite][b]生物素标记蛋白[/b][/url]详情可以参看:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/biotinylated-protein-elite[/font][/font][font=宋体] [/font]
[align=center][b]注射用水溶性维生素的分析(2)[/b][/align][align=center][b]——叶酸,生物素[/b][/align]客户提供了注射用水溶性维生素粉针剂及对照品(叶酸,生物素),要求本实验室依据客户所提供方选择合适色谱柱,满足方法中对叶酸,生物素及其前后相邻杂质的分离要求,进而达到准确定量的目的。首先,依据客户提供的色谱条件我们尝试了使用中等极性色谱柱CAPCELL PAK C18 MGII S5 4.6 mm i.d. × 150 mm(A4AB 07251),分析对照品溶液与供试品溶液,结果如图1所示,对照品溶液中叶酸及生物素得到了良好的分离结果;在分析供试品溶液时,叶酸与其后杂质峰能够得到分离度为1.83的良好分离结果。[align=center][img=,673,421]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/01/201801110920_3890_2222981_3.jpg!w673x421.jpg[/img][/align][align=center]图1 CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] MGII(150 mm)分析对照品及供试品溶液结果[/align]注*峰上所标数字为分离度,下同。[img=,673,298]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/01/201801110920_2922_2222981_3.jpg!w673x298.jpg[/img]为提高分离能力,使叶酸峰与其后杂质峰分的更远,我们尝试将色谱柱长度由150 mm换为250 mm,再一次分析供试品及对照品溶液,结果发现叶酸和生物素保留时间均明显延长,叶酸峰由16.97 min延长到29.03 min,此时叶酸峰与其后相邻杂质峰能够得到更好的分离,分离度为4.23,但同时也发现生物素峰被包于杂质峰中(如图2)。[align=center][img=,690,437]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/01/201801111011_6191_2222981_3.jpg!w690x437.jpg[/img][/align][align=center]图2 CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] MGII(250 mm)分析对照品及供试品溶液结果[/align][align=left][img=,668,303]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/01/201801111011_2127_2222981_3.jpg!w668x303.jpg[/img][/align][align=left][/align][align=left]为使客户有更多色谱柱选择,本实验室也尝试了高碳载量的SUPERIOREX ODS色谱柱对对照品溶液及供试品溶液进行分析,同样能够得到待测组分与前后杂质峰的良好分离,分离度均在2.0以上;同时,我们也发现在分析供试品时,由于供试品中复杂基质的影响,叶酸峰会出现一定的拖尾现象(如图3)。[/align][align=left][/align][align=center][img=,619,394]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/01/201801111012_1478_2222981_3.jpg!w619x394.jpg[/img][/align][align=center] 图3 SUPERIOREX ODS分析对照品及供试品溶液结果[/align][align=center][/align][align=left][img=,687,297]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/01/201801111012_3462_2222981_3.jpg!w687x297.jpg[/img][/align][align=center][/align][align=left]我们也尝试使用可以在100%水系流动相下使用的高极性AQ色谱柱分析供试品溶液及对照品溶液,发现由于整体保留时间过长而使得生物素峰被包于杂质峰中,因此,我们尝试缩短整体保留时间,在药典规定范围内,提高流动相中有机相比例,将流动相比例由磷酸二氢钾缓冲溶液-乙腈(93:7)调整为(91:9),最终发现供试品中叶酸和生物素也能够与其相邻杂质峰取得良好分离结果,且分离度更佳(见图4)。[/align][align=left][/align][align=center][img=,655,416]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/01/201801111020_155_2222981_3.jpg!w655x416.jpg[/img][/align][align=center]图4 CAPCELL PAK C[sub]18 [/sub]AQ S3分析对照品及供试品溶液结果[/align][align=left][img=,661,296]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/01/201801111021_778_2222981_3.jpg!w661x296.jpg[/img][/align][align=left][/align][align=left]综上实验结果,使用中等极性的[b]CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] MGII S5[/b] 4.6mm i.d. × 150 mm(A4AB 07251)和高碳载量的[b]SUPERIOREX ODS S5[/b] 4.6 mm i.d. × 150 mm(AZAB 12684)色谱柱,在客户原条件下,均能够实现叶酸、生物素及其相邻杂质间的良好分离;[/align][align=left]使用高极性[b]CAPCELL PAK C[sub]18[/sub] AQ S3[/b] 4.6 mmi.d. × 150 mm(A7AB 02100)色谱柱,在药典规定流动相可调整范围内,将流动相中磷酸盐缓冲液和乙腈比例调整为91 / 9(原条件为93 / 7),也可实现注射用水溶性维生素中叶酸和生物素及相邻杂质的良好分离。[/align]