淀粉样多肽

引言 &beta 淀粉样肽（A&beta ）的不溶性聚集物在脑中沉积／形成被看作为早老性痴呆病（AD）的一个关键事件。治疗策略集中于用以减少&beta 淀粉样肽生成或提高其清除水平的小分子抑制剂或免疫疗法。因此，找到能对脑脊液中的淀粉样肽进行高灵敏且稳定可靠的定量分析方法以确定其与AD关系对很多研究者来说至关重要。然而，对这些A&beta 肽的分析极具挑战性，这不仅因为其在生物液体内的丰度相对偏低，而且也因为它们可能被其它蛋白质结合并具有形成低聚体的趋势。 这些肽的测定常规采用免疫测定法（因其选择性和灵敏度）或者通过冗长的免疫沉淀之后再进行SPE。免疫测定所需的方法开发时间比LC/MS/MS方法开发时间长；它们需要对多种A&beta 肽进行多次测定，并且与LC/MS/MS相比其线性动态范围有限。免疫测定存在交叉反应性和非特异性结合，需要使用价格昂贵的抗体，并且样品／标本的富集依赖于抗体的选择性。免疫测定的劳动强度大，并且测定不准确和基质干扰也是常见的问题。因此，需要开发一种基于LC/MS/MS的高通量、选择性好的生物分析方法，使样品制备能够实现在存在高浓度干扰蛋白和肽的情况下回收得到pg/mL水平的淀粉样肽。 虽然开发免疫测定方法所需的时间在后期药物发展过程中是可接受的，但在较早的阶段中则几乎不切实际；这时，如能有一种可定量多种肽的高通量且可靠的方法则是众望所归。 本研究工作集中于开发用于淀粉样前体蛋白（APP）的1-38、1-40和1-42片段的LC、MS和选择性SPE样品制备方法，以支持临床前研究。使用单一、高通量方法用于多种A&beta 肽的分析测定而无需耗时的免疫沉淀步骤，被成功开发并经过验证。特别是，A&beta 类肽存在很多独特的分析挑战，其中包括非特异性结合、溶解性差、聚集和质谱灵敏度偏低。在方法开发各阶段所进行的步骤尽可能减小或消除了这些问题所带来的影响。 随着AD病情缓解策略的出现，对除了A&beta 38、40和42之外的多种可能与AD病征相关的A&beta 进行定量分析可有助于提供关于此病及其发展过程的更多认识。本文所述的方法也有可能进行相应的修改，以使其适用于那些肽的定量分析。 &beta 淀粉样1-38肽，分子量4132，pI 5.2 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG &beta 淀粉样1-40肽，分子量4330，pI 5.2 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV &beta 淀粉样1-42肽，分子量4516，pI 5.2 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 图1：&beta 淀粉样肽1-38、1-40和1-42的氨基酸序列和pI数据 实验 UPLC® 方法的条件 色谱柱： ACQUITY UPLC® BEH C18，300Å ，2.1× 150nm，1.7µ m 流动相： A：0.3% NH4OH（按体积计算）的水溶液 B：90%乙腈，10%流动相A 梯度： 90% A保持1分钟，5.5分钟内降低至55% A并保持0.2分钟，然后返回至初始水平 流速： 0.2 mL／分钟 进样量： 10µ L 温度： 50℃ 质谱条件 系统：沃特世XevoTM TQ三重四极杆质谱仪，在ESI+MRM模式下运行 去溶剂化气体流速：800L／小时 源温度：120℃ 去溶剂化温度：450℃ 碰撞室压力：2.6× 10(-3)毫巴 MRM跃迁态和条件：见表1 样品预处理 用5M盐酸胍以1:1的比例稀释200µ L脑脊液（人脑脊液、猴脑脊液或加标人工脑脊液+5%大鼠血浆），并在室温下振摇45分钟。然后，用200µ L 的4%H3PO4水溶液进一步稀释样品。 注意：对于加标样品而言，在加标后、用盐酸胍稀释前，可在室温下让样品平衡30分钟。 固相萃取（SPE） 基于µ Elution 96孔型的Oasis® MCX 预处理：200µ L甲醇 平衡：200µ L 4% H3PO4水溶液 上样：600µ L预处理后的样品 清洗1：200µ L 4% H3PO4水溶液 清洗2：10% ACN水溶液 洗脱：2× 25µ L 75:15:10 ACN:水:NH4OH浓溶液 稀释：25µ L水 进样量：20µ L 肽名称 前体离子 产物离子 产物离子ID锥孔电压（V） 碰撞能量（eV） &beta 淀粉样1-38肽 1033.5 1000.3 b 36 33 23 &beta 淀粉样1-38肽的N15内标 1046 1012.5 30 22 &beta 淀粉样1-40肽 1083 1053.6 b 39 33 25 &beta 淀粉样1-40肽的N15内标 1096 1066.5 35 22 &beta 淀粉样1-42肽 1129 1078.5 b 40 28 30 &beta 淀粉样1-42肽的N15内标 1142.5 1091.5 35 28 表1：&beta 淀粉样肽及其N15标记型内标的MRM跃迁态和质谱条件 结果和讨论 开发这些方法所遇到的最大挑战就是克服溶解性、吸附性和聚集性问题并获得能满足该应用要求的足够选择性和灵敏度。适当的流动相和进样溶剂构成以及明智选择SPE洗脱溶剂仅仅是应对这些问题的几个关键因素。 质谱分析 质谱分析在正离子模式下进行，因为4+前体的CID产生了几种与固有的特异性b序列离子相对应的不同产物离子（典型光谱如图2所示）。负离子模式下的MS/MS出现了明显的水分流失。图3给出了关于两种方法特异性区别的一个示例。虽然对于溶剂标准品时使用负离子模式的总体灵敏度较高，但在基质存在时负离子模式的灵敏度优势减弱，而正离子模式下的特异度和信噪比的提高对于脑脊液样品中的准确定量具有决定性作用。 超高效液相色谱分析 图4显示了对这三种&beta 淀粉样肽的分离情况。虽然流动相中NH4OH的精确百分比对负离子灵敏度具有关键作用，但ESI+模式下的信号经证实对流动相构成的细微变化更具稳健性，可使液相色谱／自动取样器至少在24小时以上的时间段中保持稳定。与此相反，50%或以上的ESI-信号在10-12小时后因流动相中NH4OH浓度的自然变化（挥发）而损失。这进一步强调了ESI+MS方法的稳健性。 固相萃取（SPE） SPE使用Oasis® MCX（一种混合模式的吸附剂）进行，以加强萃取过程的选择性。该吸附剂同时依赖于反相和离子交换保留机制，以从复杂脑脊液样品中的其它高丰度多肽中选择性分离&beta 淀粉样肽组分。使用特定的96孔Oasis® µ Elution提供了明显的浓缩效果，无需溶剂挥干和复溶，从而尽可能减少了肽损失。此外，通过离子交换进行肽结合为整个方法提供了正交性。 在最初的方法开发过程中，萃取人工脑脊液时观察到了大量非特异性结合（NSB）。我们添加了5%大鼠血浆（有一个不同的&beta 淀粉样肽序列），以消除NSB。 SPE是整个方法中较为重要的环节之一。对淀粉样组分选择性极高的分离再加上标准流速下UPLC的分辨率实现了对临床前研究样品的超快分析。 线性、准确度和精确度 对每种肽均使用了N15标记型内标。对于0.1-10ng/mL人工脑脊液+5%大鼠血浆的等分样本，三种&beta 淀粉样肽的标准曲线均呈线性。&beta 淀粉样1-38肽的典型标准曲线如图5所示。淀粉样肽的基线水平根据同时使用过量加标的人脑脊液和&ldquo 人工脑脊液+5%大鼠血浆&rdquo 而得到的两条标准曲线进行定量分析，基线水平的计算值没有统计学意义上的差异。选择人工脑脊液是因为它的价格不贵，而且是一种比较易得的基质。从3种人脑脊液和1种猴脑脊液萃取得到的&beta 淀粉样1-42肽的基线水平如图6所示。所有3种&beta 淀粉样肽的基线水平测定值的统计结果如表2所示。 用3种人脑脊液混合样品和1种猴脑脊液混合样品配制了0.2、0.8、2和6ng/mL的过量加标的质控样品。准确度和精确度数值符合LC/MS/MS测定的控制标准。质控样品分析的典型结果如表3所示。 结果和讨论 开发这些方法所遇到的最大挑战就是克服溶解性、吸附性和聚集性问题并获得能满足该应用要求的足够选择性和灵敏度。适当的流动相和进样溶剂构成以及明智选择SPE洗脱溶剂仅仅是应对这些问题的几个关键因素。 质谱分析 质谱分析在正离子模式下进行，因为4+前体的CID产生了几种与固有的特异性b序列离子相对应的不同产物离子（典型光谱如图2所示）。负离子模式下的MS/MS出现了明显的水分流失。图3给出了关于两种方法特异性区别的一个示例。虽然对于溶剂标准品时使用负离子模式的总体灵敏度较高，但在基质存在时负离子模式的灵敏度优势减弱，而正离子模式下的特异度和信噪比的提高对于脑脊液样品中的准确定量具有决定性作用。 超高效液相色谱分析 图4显示了对这三种&beta 淀粉样肽的分离情况。虽然流动相中NH4OH的精确百分比对负离子灵敏度具有关键作用，但ESI+模式下的信号经证实对流动相构成的细微变化更具稳健性，可使液相色谱／自动取样器至少在24小时以上的时间段中保持稳定。与此相反，50%或以上的ESI-信号在10-12小时后因流动相中NH4OH浓度的自然变化（挥发）而损失。这进一步强调了ESI+MS方法的稳健性。 固相萃取（SPE） SPE使用Oasis® MCX（一种混合模式的吸附剂）进行，以加强萃取过程的选择性。该吸附剂同时依赖于反相和离子交换保留机制，以从复杂脑脊液样品中的其它高丰度多肽中选择性分离&beta 淀粉样肽组分。使用特定的96孔Oasis® µ Elution提供了明显的浓缩效果，无需溶剂挥干和复溶，从而尽可能减少了肽损失。此外，通过离子交换进行肽结合为整个方法提供了正交性。 在最初的方法开发过程中，萃取人工脑脊液时观察到了大量非特异性结合（NSB）。我们添加了5%大鼠血浆（有一个不同的&beta 淀粉样肽序列），以消除NSB。 SPE是整个方法中较为重要的环节之一。对淀粉样组分选择性极高的分离再加上标准流速下UPLC的分辨率实现了对临床前研究样品的超快分析。 线性、准确度和精确度 对每种肽均使用了N15标记型内标。对于0.1-10ng/mL人工脑脊液+5%大鼠血浆的等分样本，三种&beta 淀粉样肽的标准曲线均呈线性。&beta 淀粉样1-38肽的典型标准曲线如图5所示。淀粉样肽的基线水平根据同时使用过量加标的人脑脊液和&ldquo 人工脑脊液+5%大鼠血浆&rdquo 而得到的两条标准曲线进行定量分析，基线水平的计算值没有统计学意义上的差异。选择人工脑脊液是因为它的价格不贵，而且是一种比较易得的基质。从3种人脑脊液和1种猴脑脊液萃取得到的&beta 淀粉样1-42肽的基线水平如图6所示。所有3种&beta 淀粉样肽的基线水平测定值的统计结果如表2所示。 用3种人脑脊液混合样品和1种猴脑脊液混合样品配制了0.2、0.8、2和6ng/mL的过量加标的质控样品。准确度和精确度数值符合LC/MS/MS测定的控制标准。质控样品分析的典型结果如表3所示。 1. 我们开发了一种用于同步定量分析人和猴脑脊液中多种&beta 淀粉样肽的SPE-LC/MS/MS生物分析方法并对其进行了验证。 2. 将基于µ Elution型混合模式SPE的高选择性萃取方法与UPLC色谱分析的分辨率相结合是实现对人和猴脑脊液中3种主要&beta 淀粉样肽进行准确、精确而可靠的定量分析的关键。 3. 正离子MS/MS和b离子序列碎片的使用提供了本应用所需的质谱特异度。 4. 用不到30分钟的时间即可完成对96份样品的萃取并作好进样准备，从而满足了临床前研究所需的样品制备处理通量要求。 5. 本文所述的方法避免了在临床前研究工作中进行耗时的免疫测定或免疫沉淀步骤。 6. Xevo TQ质谱的质量范围和灵敏度允许选择高m/z前体进行破碎并能选择特异度高的b离子碎片，从而增加了此项测定的信噪比并总体提高了其特异度。 7. 此类方法也可允许选择性的、特异性的、并按高通量方式同时测定一份样品中的几种不同&beta 淀粉样肽，而同时仍能达到低浓度内源性&beta 淀粉样肽分析所需的高灵敏度。这是一个明显的优点，因为ELISA测定需要使用多种抗体进行多次测定。 所选择的参考文献 1. T.A. Lanz、J.B. Schachter．神经科学方法杂志，169 (2008) 16-22. 2. T. Oe等．质谱分析中的快速通讯，20 (2006) 3723-3735. 3. JR Slemmon等．色谱分析杂志：生物分析，846 (2007) 24-31. 4. NT Ditto等．神经科学方法杂志，182 (2009) 260-265. 5. T.A. Lanz、J.B. Schachter．神经科学方法杂志，157 (2006) 71-81. 6. MJ Ford等．神经科学方法杂志，168 (2008) 465-474. 7. E. Portelius等．蛋白质组学研究杂志，6 (2007) 4433-4439. 致谢 本文作者希望向Wenlin Li（辉瑞公司PDM部）表达谢意，感谢她在使用免疫亲和LC/MS/MS分析&beta 淀粉样肽所作的前期工作。 沃特世公司 美国马萨诸塞州米尔福德Maple街34号，01757 电话：(508) 478-2000；传真：(508) 478-1990 http://www.waters.com

在阿尔茨海默病（AD）进展中，存在beta淀粉样蛋白（β-Amyloid，Aβ）的积累。Aβ在受影响的脑组织区域形成病理性聚集，被认为与AD的发生、进展和表型密切相关。多种翻译后修饰（如磷酸化、硝基化、糖基化等）对Aβ的病理性聚集及体内生物活性具有重要且不同的调控作用。在AD患者脑内，多种病理相关蛋白的糖基化位点、数量和水平都发生了显著性改变，表明了糖基化修饰在AD发生和发展中的重要意义。2011年，科学家对AD病人脑脊液中的Aβ片段进行鉴定，检测到之前未在哺乳动物中发现的酪氨酸O-糖基化修饰，然而由于天然来源的翻译后修饰蛋白丰度低、微观不均一等困难，Aβ糖基化修饰的生物学功能及在疾病中的作用尚未能得以阐释。　　近日，中国科学院上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心刘聪课题组与北京大学药学院董甦伟课题组合作，在J. Am. Chem. Soc.上发表题为O-Glycosylation Induces Amyloid-β to Form New Fibril Polymorphs Vulnerable for Degradation的研究论文，利用化学合成策略构建了一系列含不同O-糖基化修饰的均一结构Aβ，并系统研究了糖基化修饰对Aβ病理性聚集的调控作用及其构效关系。　　该研究中，研究人员首先合成了三种O-糖修饰的酪氨酸砌块，糖基分别是α-GalNAc, Galβ1-3GalNAc和Neuα2,3Galβ1-3GalNAc。然后，通过固相多肽合成策略将上述三种酪氨酸砌块制备相应的Aβ糖肽。然而，Aβ含有较多大位阻氨基酸，且自身疏水性强、容易聚集，再加上糖基的引入，给Aβ糖肽的合成带来了不少困难。为了克服这些合成难题，研究人员利用微波辅助的合成策略以及多赖氨酸亲水标签等方法，以较高效率获得了结构均一、含有不同O-糖修饰的Aβ糖肽。他们进一步对三种Aβ糖肽和不含糖链的Aβ多肽进行性质表征，发现糖基化修饰能够显著抑制Aβ的聚集，并且抑制效果与糖链结构相关。通过对Aβ聚集/解聚动力学的进一步研究，表明糖基修饰可以降低纤维结构的稳定性。在酶解实验中，糖基修饰的Aβ纤维表现出了更差的酶解稳定性。　　为进一步阐述糖基化修饰降低Aβ纤维稳定性的分子机理，研究人员通过冷冻电镜技术（Cryo-EM），获得了Galβ1-3GalNAc糖型Aβ纤维的3.1埃近原子级分辨率结构。糖基修饰的Aβ组装形成了一种全新的淀粉样纤维结构，其纤维核心由6-42位氨基酸残基组成，并且在Tyr10残基侧链附近可以观察到修饰糖基的电子密度。通过与未修饰的Aβ纤维核心结构进行比较，研究发现Tyr10的糖基化会增大其与相邻氨基酸残基的空间位阻，从而导致整个Aβ纤维核心结构的重排。相较而言，糖基化Aβ纤维的结构具有更小的原纤维间交互界面，且仅由两对盐桥（Asp23和相邻原纤维的Lys28）所维持。这为糖基化修饰降低Aβ纤维稳定性提供了分子层面的解释。　　该工作首次发现糖基化修饰在动态调控Aβ病理性聚集方面的重要功能，为后续研究不同糖基修饰对神经退行性疾病病理蛋白聚集的生物活性及病理毒性的调控作用，提供了有利的研究工具及新的研究思路。该工作得到了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委和中科院稳定支持基础研究领域青年团队计划的资助。　　论文链接

p style=" text-indent: 2em " 中国计量科学研究院李红梅、冯流星团队近期在Analytical& nbsp Chemistry，2020，doi.org/10.1021/acs.analchem.0c02381发文，介绍了基于同位素稀释质谱技术的阿尔茨海默症临床诊断标志物（Aβ）纯度标准物质研制方法。冯流星研究员为该论文的第一作者，李红梅研究员为共同通讯作者。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/3c6fdaac-2942-41af-8bf7-0a1235c51c2b.jpg" title=" 1-1.png" alt=" 1-1.png" / /p p style=" text-indent: 2em " 阿尔兹海默症（Alzheimer& #39 s disease，AD）是不可逆的神经退行性疾病，随着人口的老龄化，AD的发病率越来越高，其致病机理和临床治疗已引起了广泛关注。众多临床研究表明， 血液、脑脊液和脑组织内的β淀粉样多肽（β amyloid peptide ，Aβ）水平异常与AD的病程进展密切相关，Aβ已成为目前研究AD的重要生物标志物之一。然而，临床上由于缺乏Aβ检测的标准物质，导致不同测量系统对Aβ的检测结果偏差较大，难以对AD病的病程进行准确的判断。因此，研制绝对准确的Aβ的定量方法及相关标准物质，对AD的早期诊断及治疗药物研发具有重要意义。 /p p style=" text-indent: 2em " & nbsp 针对这一难题，李红梅团队研制了β淀粉样多肽（Aβ）纯品溶液标准物质（GBW09874-09875），采用基于氨基酸水解同位素稀释质谱法和硫元素同位素稀释质谱法的两种独立参考方法对Aβ纯度进行定值，量值准确可靠、不确定度评定合理。该标准物质为Aβ纯度标准物质，位于ISO17511溯源链的顶端，为AD症诊断中Aβ标志物检测参考方法的建立提供溯源源头。 /p p style=" text-align: center margin-top: 10px " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/160d2075-9f54-41f7-8217-0ffea64861d7.jpg" title=" 1-2.png" alt=" 1-2.png" / /p p style=" text-align: center " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong span style=" font-size: 14px " 基于ID-LC-MS和HPLC-ID-ICP-MS两种方法Aβ标准物质定值示意图 /span /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" color: rgb(0, 0, 0) font-size: 16px " /span /p p strong span style=" color: rgb(127, 127, 127) " 学者简介： /span /strong /p p span style=" color: rgb(38, 38, 38) " 李红梅：研究员，中国计量科学研究院化学所所长。享受国务院政府特殊津贴，全国“三· 八”红旗手荣誉称号获得者 /span /p p span style=" color: rgb(38, 38, 38) " 冯流星：研究员，中国计量科学研究院化学所无机化学研究室主任 /span /p