脱甲氧姜黄

姜 黄姜黄具有活血化瘀，通经止痛等功能，为姜科植物姜黄Curcuma Longa L.的干燥根茎，含有大量色素和挥发油类成分，这些成分会造成GC-MS/MS分析中目标物保留时间漂移、干扰大、严重污染色谱柱等问题，从而导致分析结果误差过大、回收率不达标，其中六六六类化合物干扰较为明显；同样也会造成LC-MS/MS分析中目标物响应变低、丢峰等问题，其中地虫硫磷和甲拌磷砜干扰较为明显。纳谱分析推出的HLB-C中药农残专用柱，特别适用于重色素和重油脂的中药材农残测定。今天，我们来看看姜黄项目的前处理效果吧。适用范围本方法参考中国药典2020版2341第五法中的固相萃取法二，适用于含色素、挥发油类成分的中药材的农残检测。实验步骤一 / 对照品溶液的制备1.1 混合对照品配制精密量取禁用农药混合1 mL，置20 mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，备用；1.2 气相色谱-串联质谱法分析用内标溶液的制备取磷酸三苯酯对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并制成每1 mL含1.0 mg的溶液，即得。精密量取适量，加乙腈制成每1 mL含0.1 μg的溶液。1.3 空白基质溶液的制备取空白基质样品，同供试品溶液的制备方法处理制成空白基质溶液。1.4 基质混合对照溶液的制备分别精密量取空白基质溶液1.0 mL(6份），置氮吹仪上，40 °C 水浴浓缩至约0.6 mL，分别加入混合对照品溶液10 μL、20 μL、50 μL、100 μL、150 μL、200 μL，加乙腈稀释至1 mL，涡旋混匀，即得。二 / 供试品溶液的制备（直接提取法）提取：精密称取5 g样品（3号筛），加氯化钠1 g，加入50 mL乙腈，匀浆处理2 min，离心后分取上清液，残渣再加50 mL乙腈，匀浆处理1 min，离心后，合并两次提取上清液，减压浓缩至3~5 mL左右，加乙腈定容至10 mL，摇匀，置冰箱冷藏2 h，取出离心1 min，取上清液至新的离心管内，放置至室温待净化。三 / 净化GC-MS/MS净化：SPE柱：SelectCore HLB-C中药农残专用柱 500mg/6mL净化：取SelectCore HLB-C固相萃取柱 500mg/6mL，加乙腈5ml活化，再取上述姜黄提取液1mL置已活化的SelectCore HLB-C固相萃取柱中，收集样品液，待所有样品液进入柱体填料后，取5mL乙腈洗脱，合并样品液与洗脱液，即得。GC-MS/MS测定：基质加标配制：取上述净化后的样品液与洗脱液的混合液40 ℃氮吹至0.6 mL加入混合对照溶液，乙腈定容至1 mL，再加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液，混匀，过0.22 μm尼龙针式过滤器，上机分析。样品溶液配制：取上述净化后的样品液与洗脱液的混合液40 ℃氮吹至1 mL加入0.3 mL磷酸三苯酯溶液，混匀，过0.22 μm尼龙针式过滤器，上机分析。LC-MS/MS净化：SPE柱：SelectCore HLB固相萃取柱500mg/6mL净化：量取上述姜黄提取液4 mL，过SelectCore HLB固相萃取柱500mg/6mL，收集全部净化液，混匀，即得。LC-MS/MS测定：基质加标配制：精密量取过固相萃取柱后的溶液1 mL氮吹至0.6 mL加入混合对照品液，乙腈定容至1 mL，再加入0.3 mL水，混匀，过0.22 μm尼龙针式过滤器，上机分析。样品溶液配制：精密量取过固相萃取柱后的溶液1 mL加入0.3 mL水，混匀，过0.22 μm尼龙针式过滤器，上机分析。四 / 气相色谱-串联质谱法（岛津GC-MS-TQ8040 NX）4.1 色谱条件色谱柱：NanoChrom BP-50+MS,30m×0.25mm×0.25μm进样口温度：250 ℃升温程序：初始温度为60 ℃，保持1 min； 以10 ℃/min升温至160 ℃； 再以2 ℃/min升温至230 ℃ 最后以15 ℃/min升温至300 ℃, 保持6 min；载气：高纯氦气（纯度99.999%）；进样方式：不分流进样；恒压模式：146 kPa；进样量： 1 μL4.2 质谱条件 电离方式：电子轰击电离源（EI）；电离能量：70 Ev；接口温度：250 ℃；离子源温度：250 ℃；监测方式：多反应监测模式（MRM）；溶剂延迟：10 min五 / 高效液相色谱-串联质谱法（岛津LC-MS 8045）5.1 色谱条件色谱柱：ChromCore C18-MS Pesticides, 2.6μm, 2.1×100mm流动相：A:0.1%甲酸水溶液(含有5 mmol/L甲酸铵) B:乙腈-0.1%甲酸水溶液(含有5 mmol/L甲酸铵)=95:5流速：0.3 mL/min柱温：40 ℃进样量：2 µL梯度：时间(min)流速(mL/min)流动相A(%)流动相B(%)00.3703010.37030120.30100140.3010014.10.37030160.370305.2 质谱条件离子源：电喷雾离子源(Electrospray ionization, ESI) 正离子扫描监测方式：多反应监测(Multiple Reaction Monitoring, MRM)接口电压：4.5 kV雾化气：氮气3.0 L/min加热气：干燥空气10.0 L/minDL温度：250 ℃加热模块温度：400 ℃接口温度：300 ℃干燥气：N2 10 L/min六 / 注意事项GC-MS/MS：内吸磷、灭线磷和久效磷参考LC-MS/MS分析结果；LC-MS/MS：地虫硫磷参考GC-MS/MS分析结果，采集条件参考下表；水胺硫磷参考GC-MS/MS分析结果；如遇个别目标物回收率低于60%可将上柱净化量增加到5 mL七 / 实验结果姜黄基质加标GC-MS/MS部分化合物分析结果谱图姜黄基质加标LC-MS/MS部分化合物分析结果谱图表1 姜黄中33种农药残留的测定添加回收结果（%）八 / 实验结论通过以上实验数据可以看出，姜黄使用SelectCore HLB-C 500mg/6mL中药农残专用柱处理对其色素类成分、挥发油吸附良好，有效地减轻了样品中色素和挥发油成分对GC-MS/MS柱前端的污染和基质中干扰物对目标物的影响；并且使用SelectCore HLB 500mg/6mL固相萃取柱处理的姜黄LC-MS/MS基质加标液中化合物出峰良好，搭配上述解决办法可以有效解决姜黄中农残分析中存在的问题，提高了实验效率，为姜黄的农药残留实验数据的稳定性和可靠性提供了良好的帮助。

植物外泌体样纳米囊泡（plant exosome-like nanovesicles，PELNVs）是源于植物真核细胞的多泡体，通过后者与质膜融合释放到细胞外的一种膜性小囊泡。与此同时，来源于药用植物的姜黄(Curcuma longa)作为一种中药，常用于降血脂、抗肿瘤、抗炎等疾病，姜黄素作为从姜黄中所提取的一种天然疏水多酚，姜黄外泌体样纳米囊泡除了具有相应药理作用外，还兼具纳米载体的独特形态与组成特征，相比哺乳动物来源和人工合成的纳米囊泡，姜黄植物外泌体纳米囊泡具有来源广泛、价廉易得、功能丰富等优势，因此具有大规模生产的可行性。炎症性肠病（IBD），是一种特殊的慢性肠道炎症疾病，主要包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。随着生活水平的提高和饮食结构的变化，我国IBD发病率有不断攀升的趋势，已逐渐成为我国消化科的常见病。发展IBD诊疗新技术、新方法，将为IBD的综合防治提供有效依据，研究人员受姜黄药物价值的启发，进一步研究了姜黄外泌体样纳米囊泡在IBD治疗中的作用及分子机制。作者首先将植物姜黄用萃取器均质，然后采用蔗糖梯度超离心法获取姜黄外泌体样纳米囊泡(TDNPs)，并通过透射电镜、原子力显微镜、质谱分析等方式对TSNPs 1和TDNPs 2做出相关比较（图1）。图1. TDNPs的分离、纯化与表征接下来，作者研究了TDNPs 2的靶向性，使用IVISense™ DiR 750 (XenoLight™ DiR)标记TNDPs，灌胃结肠炎小鼠。通过Perkinelmer的IVIS成像系统对消化道、肠系膜淋巴结（MLN）和重要器官（心、肝、脾、肺和肾）进行成像，发现与PBS组、TDNPs 1治疗组的小鼠相比，TDNPs 2治疗组的小鼠结肠中有强烈的DIR信号，证实了TNDPs 2优先作用于炎症结肠部位（图2）。图2. TDNPs 2优先作用于炎症结肠部位随后在TDNPs 2优先定位于炎症结肠的条件下，进一步研究了TDNPs 2对DSS诱导结肠炎的影响，通过构建小鼠结肠炎模型，使用炎症探针通过化学发光成像进行监测。Lcn-2作为一种有吸引力的肠道炎症生物标志物，被用来监测肠道炎症的进展。作者通过研究Lcn-2在DDS、DSS+TDNPs 1、DSS+TDNPs 2三组中的水平变化，证实了TDNPs 2可减轻DSS诱导的结肠炎。IVIS生物发光结果显示，DSS组和DSS+TDNPs 1治疗组小鼠的腹部显示较强的生物发光信号，表明消化系统内存在严重的炎症反应。相反，虽然DSS+TDNPs 2治疗组的小鼠腹部仍有部分生物发光信号，但强度远低于DDS组和DSS+TDNPs 1治疗组小鼠。作者同时还评估了结肠组织中髓过氧化物酶(MPO) 、促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-1β)和氧化应激相关蛋白HO-1的表达水平，证实了TDNPs 2具有明显的抗炎和抗氧化作用（图3）。同时作者评估了TDNPs 2是否能够加速结肠炎的快速消退。通过体外伤口愈合试验，证实了TDNPs 2处理的细胞具有最快修复创面的速度，能够显著缓解DSS诱导的溃疡性结肠炎及促进炎症的快速消退。图3. 口服TDNPs 2可减轻DSS引起的结肠炎随后该团队为满足潜在临床应用，首先评估了TDNPs 2对Caco2细胞的毒性，通过MTT、ATPLite、细胞凋亡、活化caspase-3/7等证明了TDNPs 2具有良好的生物相容性。接下来，通过H&E染色对肝脏等器官进行组织学分析，证实了TDNPs 2在体内的生物安全性。最后作者研究了TDNPs 2是否影响NF-κB信号通路，NF-κB是一种重要的核转录因子，在调节炎症反应中发挥着重要作用。姜黄素是一种NF-kB抑制剂，具有广泛的性能。作者通过检测NF-κB p65依赖的荧光素酶活性、磷酸化NF-κB p65表达和p65转位到细胞核的共聚焦成像，表明了TDNPs 2可以抑制LPS对NF-κB通路的激活。同时为了研究TDNPs 2在体内对NF-κB通路的抑制作用，采用NF-κB-RE-Luc转基因小鼠对NF-κB进行了研究。通过采集重要器官(心脏、肝脏、脾脏、肾脏和肺)和结肠并成像。IVIS生物发光结果显示，心肝脾肺肾的生物发光信号相似，表明NF-κB在这些器官中的活性相似。相反，结肠的生物发光信号，TDNPs 2治疗组较DSS组明显降低。表明了TDNPs 2是通过抑制NF-κB信号通路发挥保护作用（图4）。图4. TDNPs 2通过抑制NF-κB信号通路发挥保护作用参考文献Oraladministration of turmeric-derived exosome-like nanovesicles withanti-inflammatory and pro-resolving bioactions for murine colitis therapy. JNanobiotechnol 20, 206 (2022).https://doi.org/10.1186/s12951-022-01421-w

宝藏姜黄——看看步琦如何来挖宝！姜黄也被称为郁金，是有很多功效的植物。姜黄能活血行气，具有降血脂，抗肿瘤等作用。姜黄中主要的成分姜黄素是一种天然化合物，姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种二酮类化合物。其中，姜黄中约含姜黄素 3%～6%，姜黄素为橙黄色结晶粉末，味稍苦，不溶于水，在食品生产中也能用于肠类制品、罐头、酱卤制品等产品的着色。姜黄素具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用，另外，也有科学家发现姜黄素有助治疗耐药结核病。在本文中利用全频固液萃取仪 E-800 热萃取法提取的，采用紫外/可见分光光度法测定姜黄素总含量。1仪器BUCHI 全频固液萃取仪 E-800分析天平(精度 ± 0.1 mg)紫外/可见分光光度计BUCHI 旋转蒸发仪 R-1002试剂与样品95%乙醇合成姜黄素为了安全处理，请遵循相应MSDS!示例：有机姜黄素粉，标记姜黄素含量:3.7%，样品是粉末，因此不需要额外的均质。3姜黄素含量的测定包括以下步骤标准溶液的制备姜黄粉直接提取紫外/可见分光光度法测定姜黄素含量3.1 标准溶液的制备将 25mg 姜黄素倒入 100mL 的量瓶中，溶解并稀释至乙醇。注意准确的重量！将 0.5 mL, 1 mL 和 2mL 原液转移到三个不同的 100mL 容量烧瓶中，用乙醇定量。对于0.5 mL、1 mL和2 mL转移的原液，这些标准溶液分别含有 1.25、2.5 和 5 mg/L 的姜黄素(根据确切重量而定)。将萃取纸滤筒放入萃取腔支架中。称 0.1 克均匀样品到萃取纸滤筒中。注意准确的重量。用棉絮覆盖在萃取纸滤筒内的样品。将含有样品的纤维素顶针放入提取室，并将液位传感器调整到样品的高度。将溶剂倒入烧杯中，放在相应的加热板上。关闭防护罩，降下萃取架，激活萃取位置，打开冷却水水龙头或接通连接的冷水机。根据表 1 中列出的参数启动热提取。表1：全频固液萃取仪 E-800 热萃取参数步骤_加热等级萃取方法热萃取_溶剂乙醇上萃取腔 9下加热 18萃取2.5h/3h热萃取淋洗10min18干燥AP11溶剂体积（mL）120_提取液转移到 100mL 容量瓶中。烧杯中的残留成分用额外的乙醇冲洗，然后定容到 100 毫升。注意：回收的溶剂应单独收集。再次使用前，通过测定吸光度来检查溶剂中姜黄素的杂质，并将其与纯溶剂进行比较。如果有杂质，必须使用纯溶剂开始清洗方法(例如淋洗30分钟)来清洗索氏腔。回收的溶剂可以通过蒸馏收集和纯化，例如使用旋转蒸发器 R-100。3.2 UV / Vis 分光光度法样品溶液：将 2.0mL 的提取溶液转移到 25mL 的量瓶中，用乙醇定容。测定样品溶液的吸光度，并与乙醇在 425nm处的吸光度进行了比较。3.3 姜黄素的浓度与吸光度之间的关系可由以下方程得到其中：A：姜黄素类化合物在 425 nm 处的吸收率an：标准溶液 n 在 425 nm 处的吸光度d：光路长度 (1 cm)cn：标准溶液浓度 n，单位为 mg/L3.4 姜黄素百分含量按下式计算其中：% Curcuminoids：样品中姜黄素含量的百分比mSample：样品重量 [g]cs：样品溶液的浓度为 mg/L4结果用紫外/可见分光光度计对标准溶液进行分析。用线性回归法确定了浓度与吸光度的相关性，该方法仅适用于标准溶液所涵盖的范围。对于姜黄素的测定，姜黄样品在 2.5h (150分钟) 和 3 h(180分钟) 提取时间内进行三次分析。结果如表2所示。表2：姜黄粉中姜黄素含量测定结果姜黄素含量测定值为 3.7%，与标记值吻合较好。当提取时间从 2.5 小时增加到 3 小时时，姜黄素含量并没有增加，说明 2.5 小时后提取完全。用全频固液萃取仪 E-800 测定姜黄粉中姜黄素含量，结果可靠，重复性好。6 位可同时进行萃取，提高效率，每个位置独立运行。