甲基莲心碱

DNA甲基化是哺乳动物基因组中最常见的表观遗传事件之一，即DNA中核苷酸与甲基基团的共价修饰[2]。DNA甲基化与人的生命进程有着密不可分的关系。细胞的增殖与分化、染色体完整性的维护或者X染色体的活性等等都离不开DNA甲基化的控制，DNA甲基化流程在胚胎发育中是无处不在的[1]。如果DNA甲基化进程出现异常，会导致生物体出现各种各样的疾病以及身体的生长缺陷或生理紊乱。DNA与蛋白质之间的相互作用如果出现异常，会影响基因的表达，从而引起人体内肿瘤的发生或者肿瘤的转移，这一切的源头都是DNA甲基化进程出现异常的结果[3]。DNA甲基化酶是肿瘤治疗靶点DNA甲基化酶是一种修饰酶，经常与限制性内切酶一同出现。在真核生物基因组以及原核生物基因组中，普遍存在DNA甲基化酶维持以及催化DNA甲基化过程的现象。DNA甲基化酶被广泛认为是一种治疗靶点以及预测生物甲基化过程的标志物，在单细胞水平上准确灵敏地检测DNA甲基化酶对于肿瘤医学上的临床诊断以及临床治疗甚至是生物学研究有着至关重要的作用。根据甲基化的核苷酸和位置被分为三组，即腺嘌呤的甲基化、胞嘧啶的4-N甲基化和胞嘧啶的5-C甲基化。所有已知的DNA甲基化酶在其甲基化过程中以s-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体。最常见的DNA甲基化不仅发生在胞嘧啶嘧啶环5-C位置的CpG位点上，还发生在对称四核苷酸5’-G-A-T-C-3’ 中腺嘌呤环的6-N位置[4,5]。传统DNA甲基化酶检测方法有局限 DNA甲基化酶活性的高灵敏度检测在基因调控、表观遗传修饰、临床诊断和治疗等方面具有重要意义。传统用于检测DNA甲基化酶活性的方法包括高效液相色谱法(HPLC)[6], 聚合酶链反应(PCR)[7]，凝胶电泳[8]，高效毛细管电泳(HPCE)[9]，以及使用同位素标记的s-腺苷甲硫氨酸甲基化检测[10,11]。尽管这些技术在实验室实践中被证明是有用的，但它们具有局限性。例如，大多数技术不仅使用笨重昂贵的设备，而且需要复杂的样品制备和数据分析所需的大量时间。同位素标记等技术是有效的，但它们往往需要费力的样品制备、同位素标记、复杂的设备和大量的DNA，使得它们不适合在医护点使用。所以，DNA甲基化酶活性检测迫切需要简单、便携、高灵敏度和低成本的检测方法。在最近的技术进步中，许多替代的DNA甲基化酶活性测定方法，如放射法、比色法、荧光法、电化学法等已被提出。此外，其中许多与纳米材料或酶结合，以显著提高它们的敏感性。放射法、蛋白质纳米孔等新型检测技术兴起 放射法：同位素标记作为最早检测DNA甲基化酶活性的方法之一，早期广泛应用于检测DNA甲基化酶和DNA甲基化的活性[12,13]。在由DNA甲基化酶催化的甲基化过程中，同位素标记的甲基部分转移到DNA上，从而赋予甲基化的DNA放射性。这种放射性可以很方便地用闪烁计数器或放射自显像仪来检测。可惜的是，放射性试剂的介入是限制这种试验在中央实验室进行的最大缺点。对无辐射DNA甲基化酶活性检测的研究导致了甲基化特异性PCR[14]、HPCE[9]和HPLC等替代品的发展[7,14]，而甲基化特异性PCR被认为是较好的方法。尽管非放射性，上述DNA甲基化酶活性检测需要庞大且通常昂贵的设备，冗长且耗时的样品制备和数据分析，以及繁琐的检测方案，这在临床实践中也比较难以实现全覆盖。比色法：比色法用于DNA甲基化酶活性检测依赖于颜色变化的目视观察或与DNA甲基化酶相关的吸收光谱的光谱测量。它们具有成本低、简单、可移植性和在某些情况下无需仪器的优点。虽然紫外-可见光谱法可以量化DNA，但甲基化和未甲基化DNA在紫外-可见吸收特性上的低灵敏度和不显著差异基本否定了紫外-可见光谱法直接检测DNA甲基化酶活性[15~17]。金纳米粒子：金纳米粒子(AuNPs)由于其表面的等离子体共振吸收的高消光系数且强依赖于粒子间距离，在DNA甲基化酶活性检测的比色法研究中引起了广泛关注。如图1 所示，金纳米粒子表面包覆有双链DNA (ds-DNA)，其中一条链包含DNA甲基化酶识别序列和5’-硫醇末端。在DNA甲基化酶存在的情况下，如图1 B 所示，DNA甲基化酶被共价标记在ds-DNA中碱基环的6-C位置，因为在5-N位置缺乏一个质子阻止了β-消除，甲基化的DNA不能被核酸外切酶 ExoⅠ剪切，因此金纳米粒子仍然均匀地分散在溶液中 [18]。从而实现DNA甲基化酶活性的检测。结果表明，在526 nm处，金纳米粒子聚集物的吸光度与DNA甲基化酶的活性呈2 ~ 32 U / mL的线性关系，检出限为0.5 U/ mL。图1. (A)基于ABP的比色生物传感器的示意图(B) DNA甲基化酶的检测机制 荧光法：荧光指吸收激发荧光团的光，以促进电子从基态到激发态，电子迅速地回到激发态的最低能级，然后当电子最终返回基态时，发出波长较长的光。与其他DNA甲基化酶活性测定法相比，荧光法检测DNA甲基化酶活性的优点是检测过程简单，灵敏度高，但其复杂的光学性能限制了其在集中实验室的应用[19~20]。图2. 基于外切酶的靶循环的DNA甲基化酶活性检测原理图电化学法：电化学生物分析技术的发展一直是现代分析化学研究的热点之一。电化学法用于DNA甲基化酶分析包括测量电流、电压、电荷和电阻等电量，以反映DNA甲基化酶的活性。与许多其他类型的DNA甲基化酶活性的检测相比，它们具有低成本、高灵敏度、执行现场监测的能力以及非常适合微型化和集成微制造技术的优点[22~23]。Zhi-Qiang Gao等人在2014年报道了一种简单、高灵敏度的DNA甲基化酶电化学活性测定方法。该方法采用电催化氧化抗坏血酸(AA)的信号放大手段，通过一个螺纹插层N,N -2(3-丙基咪唑)-1,4,5,8-萘二酰亚胺(PIND)电催化氧化还原Os(bpy)2Cl+ (PIND-Os)，包含5’-CCGG-3’ 对称序列的ds-DNA首先固定在金电极上。然后用DNA甲基化酶孵育电极，经过酶催化特定CpG二核苷酸的甲基化，然后用识别5’-CCGG-3’ 序列的限制性内切酶 Hpa II 剪切酶处理电极，从而实现DNA甲基化酶活性检测的目的[24]。图3. DNA甲基化酶活性的检测原理示意图蛋白质纳米孔：蛋白质纳米孔检测技术是在单分子水平上以低成本、无标签和高通量的方式研究生物分子的检测技术。近年来，纳米孔技术正从生物传感的角度进行研究[25]。应用于核酸特征鉴定、化学反应过程的测量、蛋白质分析、疾病相关蛋白状态的检测以及酶动力学的研究等[26]。α-溶血7素是一种蛋白质纳米孔，它自发地插入到脂质双层膜中，形成一个纳米孔[27]。当一个带电分子在外加电势下通过蛋白质纳米孔时，它会引起离子电流的瞬态变化，电流变化事件被记录下来。被分析物可以通过当前电流发生的频率进行量化，特征电流信号则可以揭示被分析物的各种特征[28~30]。该检测方法不需要对DNA探针进行任何化学修饰，既方便又节约成本，减少了样品消耗。 图4. 用于分析DNA甲基化酶活性的纳米孔试验的示意图 在过去的十几年中，DNA甲基化酶活性的检测取得了重大进展。有几种方法有希望可在临床检测，使得该方法在用于癌症诊断、预后和治疗方面显示出了希望。比色法依赖于颜色变化的目视观察或与DNA甲基化酶相关的吸收光谱的光谱测量，具有成本低、简单、可移植性和在某些情况下无需仪器的优点，但是检出限相对较高。荧光法检测DNA甲基化酶活性的检测过程简单，检出限相对理想，但其复杂的光学性能以及昂贵的仪器设备限制了其在生活中的应用。电化学法由于需要构建较复杂的反应电极材料而使得其在临床上受到了一定的限制。蛋白质纳米孔的检测方法不需要对DNA探针进行任何化学修饰，既方便又节约成本，减少了样品消耗，检出限相对较为理想，并且已经成功应用于人类血清样本。这类检测可能最终为常规DNA甲基化酶活性的检测和分子诊断打开大门，为疾病的管理和诊断带来新的前景。 作者：王家海、骆 乐 作者简介：王家海，博士，教授，硕士生导师/博士生导师，广州大学化学化工学院；分析化学专业；主要研究领域为“基于核算纳米结构为信号传导载体的纳米孔传感器”；在核酸探针和仿生纳米孔两方面开展了一系列分子识别的工作，也为将来进一步开展分析化学研究打下了坚实的基础，期间积累了多种前沿分析方法和技术：仿生纳米孔制备和检测；微纳米加工技术；核酸探针人工合成技术。参 考 文 献 [1] 陈晓娟,闫少春,邵国,等.人DNA甲基化转移酶的分类及其功能[J].包头医学院学报,2014,30(04):136-138.[2] Das PM, et al. 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“一带一路”国际经济合作倡议的提出已有十年。在检验检测、食品安全、标准计量等诸多领域，经过市场监管部门的不懈努力，这一倡议不断从理念转化为行动，从愿景转化为现实，不仅成为当今世界广泛参与的国际合作平台和广受欢迎的公共产品，更给沿线国家百姓生活带来喜人变化。凌晨赶路，辗转一天，只为参加培训学到真东西时钟拨回3年多前。2019年10月中旬一个清晨，天边刚透出光亮，蒙古国技术人员Navchaa Dungee走出居住的村庄，在公路旁拦下一辆运牛卡车，由此踏上一段跨国旅程。想到要去中国参加水果质量安全检测技术国际培训，她的内心满怀憧憬和期待。Navchaa Dungee从库苏古尔省省会木伦市换乘火车，赶往首都乌兰巴托，与同伴汇合后，又乘坐国际大巴车前往中国内蒙古自治区二连浩特市。在那里，他们再次转程，坐上一辆开往北京的大巴车。第二天凌晨两点，一行人终于来到北京。在“输华水果质量安全检测技术国际培训班”开班式上，Navchaa Dungee和其他18名学员相互进行了自我介绍，大家分别来自蒙古国、越南、泰国、孟加拉国、印度、巴基斯坦、伊朗、埃及等“一带一路”沿线国家。一系列的培训课程随后陆续开始，老师们用心讲，学员们认真学，不少关于食品检验技术的专业术语时常在耳旁听到，更在讨论、演示中一一得到解答。这次培训班由中国检验检疫科学研究院（以下简称中国检科院）承办，属于“发展中国家技术培训班”项目中的一个环节，旨在指导“一带一路”沿线发展中国家提高水果检验检测检疫技术能力，促进其与中国间贸易往来的质量和效益提升。十年来，市场监管部门高度重视服务共建“一带一路”高质量发展，积极推进与共建国家市场监管领域全方位、多领域合作。中国检科院作为国家设立的公益性检验检测检疫中央研究机构，在培训中承担了大量工作。为使培训取得良好效果，中国检科院派出优秀专家和业务骨干担任授课教师，广泛收集信息，了解和掌握学员所在国家进出口水果安全检测技术发展状况及面临的共性问题，科学设置培训课程。课程中既有包含我国进口食品检验监管、检测标准等方面的理论课程，也有涉及病虫害检验、微生物检测等的实验操作。老师用心教，学员认真学，谁都不肯浪费一分钟“很好学，热情都很高。”回想起当时参加培训的学员们，中国检科院农产品安全研究中心专家吴兴强依然印象深刻。吴兴强是本次培训班的一名授课教师，他负责讲授的课程是农药残留检测技术。“运用这种技术，一次能检测出四五百种农药的残留情况。”听到这句话，学员们都很惊叹。因为在他们的印象里，原先普遍采用的检测方法，每次最多只能检测出十几种农药残留情况。而一些提供实际操作练习的仪器更让大家兴奋不已，因为这些仪器，在自己国家平时仅用于展示，基本没机会被实际使用。“当我演示完实验操作步骤时，有的学员已经卷起袖子，跃跃欲试，谁都不愿意浪费一分钟。整个授课过程中，没有一个学员背着手站旁边闲看，或举着手机在一旁拍照，全都是抓紧机会上手练习。”回忆起上课时的情景，吴兴强笑着说。来自中国检科院植物检验与检疫研究所的副研究员田茜，是植物检验与检疫领域的资深专家，也在培训班中担任授课教师。由于地理环境差异，学员们所在各个国家的农业生产模式、果蔬进出口检测需求各异，为保证培训内容丰富、实用，老师在认真了解学员需求基础上，提前精心准备讲义资料。学员们更是带着许多疑问到课堂上寻找答案，以求回去后推动有关难题的解决，比如：印度作为世界第二大水果和蔬菜生产国，果蔬出口量巨大，检测需求旺盛，但检测能力尚有不足；越南果蔬出口量居亚洲各国前列，随着本国水果产品日渐多样化，该国正在积极寻找出口商机，但如何促进质量管理、提升食品安全水平，还需要寻找突破口；蒙古国90%的水果依靠进口，学习、借鉴先进水果检测技术和监管思路，对提升该国进口食品安全水平意义重要，但专业人才太少。“技术是通用的，学员们对提升本国检验检测检疫领域技术水平的强烈愿望也是相通的。”田茜回忆说，当时自己讲授的课程是“瓜类果斑病菌检疫鉴定技术”，就是希望能带给各国学员丰富、实用的检验检疫方面的专业技术知识。瓜类细菌性果斑病是发生在甜瓜、西瓜等葫芦科植物上的一种严重的世界性种传病害，该病发病迅速、传播速度快、爆发性强且会造成严重经济损失。由于此病往往在水果种植过程中开始发作，病菌常隐藏在种子、种苗中，有较强隐匿性，因此成为包括我国在内的许多国家进出口检疫的重点项目之一。课堂上，田茜为学员们详细讲解利用瓜类果斑病菌胶体金检测试纸条进行瓜类种苗检测的操作步骤。“相较于至少需要1至2小时检出结果的分子生物学检测方法，胶体金试纸条检测方法不需要特殊的实验仪器及设备，操作简便，仅需5—15分钟就能检出结果，更适合田间现场检测。”田茜表示，果蔬进出口检测并不局限于水果出口到他国时进行的检测，还包括水果种植过程中本国对其进行的质量监控和产地检测，目的是及时发现病害问题，降低水果出口他国时因检测不合格被退回的风险。取样、制样、加样、检测、观察……起初连怎么取样都不清楚的学员们经过老师们手把手的指导，全部熟练掌握了实验操作方法。一期培训班，一座“连心桥”，共同打造强化食品安全检验检测检疫专业力量“这次培训班，不仅为参与国带去实用的技术手段，还充分展示了我国检验检测检疫领域技术能力的进步。”中国检科院测试评价中心副主任彭涛介绍，“这不仅是对我国食品安全检验检测检疫技术进步成果的认可，也是加强与‘一带一路’沿线国家合作、增进友谊的务实举措。”“一些病害在世界范围内呈局限分布状态，某一病原物种或许并不分布于我国境内，但需要我国关注、研究。这是因为，缺失样品会导致相关检测方法开发受阻或检测精准度不高，不利于我国进口果蔬的质量安全认定。”植物检验与检疫研究所副研究员姜帆表示，希望此类培训能够持续进行下去。培训班是一个阶段的结束，也是新的开始。2020年，“输华水果质量安全检测技术国际培训班”再次筹备，受疫情影响而延迟，目前已定于今年9月举办。据了解，上次参训的学员再次表现出强烈兴趣，希望能够获知更多关于中国进口水果和蔬菜的植物保鲜要求，期待参加专门的食品检测训练，并了解中国婴儿食品进口产品质量控制体系相关情况。巴基斯坦学员Rashad Waseem Khan Qadri表示：“我参加了2019年培训，获得了很好的经验，这就是我为什么对参加培训仍感兴趣的原因。作为园艺系果树科的研究人员，我对园艺苗圃、水果生产和加工等现代园艺技术很感兴趣，也想了解更多检验检疫领域的信息。”“眼下，我院正针对课件录制等事项加紧准备，并已向‘一带一路’沿线相关国家发出参训邀请，受邀请方包括上次参加培训的19名学员。我们希望这类专业培训班能够为‘一带一路’沿线更多国家送去先进技术，并以严谨、务实、高效的态度传递出我国与各国共同进步、共谋发展的信念。”中国检科院培训中心主任徐晓丽表示。

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