二硫代联二脲

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins1。该文章的通讯作者是来自荷兰伊拉斯姆斯大学医学院的Martijn M. Vanduijn研究员。许多蛋白质中都包含着二硫键，二硫键是指连接不同肽链或同一肽链中两个不同半胱氨酸残基的巯基组成的化学键（-S-S-）。在蛋白质分子中，二硫键起着稳定肽链空间结构的作用。二硫键数目越多，蛋白质分子对抗外界影响的能力就越大。维持二硫键的完整有利于蛋白质的液相色谱分离，但却给后端的质谱分析带来了挑战。常规的方法是在质谱分析前期对蛋白质进行变性、还原、烷基化处理，这些前处理过程可以有效的减少二硫键对后续酶切或二级碎裂（MS/MS）的干扰，但却非常繁琐耗时，除了会产生副反应以外，蛋白样品也可能在前处理过程中发生丢失。一个有效的替代方法是采用电化学还原。一个配备金属电极的流通池，仅需要施加适当电压于电极上，流通池中蛋白分子上的二硫键就可以被还原。目前，这种微型电化学反应池已实现商业化，可在线连接至质谱前端，蛋白样品经电化学还原，离子源活化，二级碎裂后可直接进行基于MS/MS谱图的序列匹配。尽管如此，电化学反应池在设计、电极材料组成、流通池的大小以及施加的电势等方面仍在不断的提高与创新。免疫球蛋白（抗体）包含有多个链间/链内二硫键。Simone Nicolardi等人曾在2014年将电化学反应器与FTICR质谱联用用于单克隆抗体的分析，从MS1谱图中可以明显地观察到单克隆抗体由于链间二硫键还原后生成的重链和轻链。然而，由于还原不完全，导致重链/轻链上的链内二硫键仅部分打开。类似的不完全还原在Kasper D. Rand组中电化学还原与氢氘交换质谱联用中也能观察到。这种不完全还原会影响蛋白中肽链的精准测量（一对二硫键引起2 Da的质量偏差），同时，关闭的二硫键也会干扰其跨度区域的二级碎裂，碎裂产物也较难通过计算软件进行预测或分析。本文介绍了一种改进的在线电化学还原方法可以实现单克隆抗体链间/链内的完全还原。装置如图1所示，蛋白样品注入系统后在1μL/min的流速下进行色谱分离，色谱柱后流出液与19 μL/min的补充液（1%甲酸，50%乙腈）在T型管中混合，随后以20 μL/min的流速经过电化学反应池（电化学反应池固有体积为19 μL），最终还原后的反应液进入质谱进行检测。值得注意的是，补充液中的50%乙腈有利于蛋白变性，而1%甲酸则为还原反应提供氢原子，促进还原反应的进行。图1. 在线电化学反应池耦联质谱装置示意图为了考察整个方法的可行性及普遍适用性，作者利用该装置对一系列的单克隆抗体进行了电化学还原和质谱检测。如图2A为贝伐珠单抗在800 mV还原电势下色谱分离的总离子流图（TIC），图2B为图2A中色谱峰所对应的一级质谱图（MS1）。从MS1可以看出有两组电荷态分布分别对应重链和轻链，说明在800 mV电势下，贝伐珠单抗链间二硫键发生了还原，由于还原发生在色谱分离之后，所以重链和轻链产生了共流出，仅在TIC图中观察到一个色谱峰。相比较柱前还原，这种色谱柱后二硫键还原会导致肽链的共流出，质荷比接近的肽链则会产生重叠的电荷分布进而干扰谱图的解析。但这种方法在分析复杂的蛋白样本具有明显有优势，可以将还原后生成的肽链与蛋白母体相关联，方便溯源。图2C则为贝伐珠单抗在不同电势下的还原情况，随着电势的逐渐增加，MS1去卷积谱图上逐渐观察到部分还原生成的重链、轻链或重轻链组合，当电势达到1000 mV时，几乎所有的链间二硫键都实现了还原。对于链内的二硫键，由于还原产生的质量改变较小（轻链包含两个二硫键，还原后质量增加4.032 Da），且存在未还原、部分还原以及完全还原肽链间的信号干扰，所以不太容易从MS1谱图确认链内二硫键的还原情况。但轻重链朝高电荷态偏移（图2D）间接说明链内二硫键在打开，肽链更加舒展，更容易质子化。图2. 在线还原系统分析贝伐珠单抗：A）贝伐珠单抗总离子流图；B）对应色谱峰的一级质谱图；C）在不同还原电势下的一级质谱图（去卷积）；D）重链在不同还原电势下电荷态的偏移。为了更加准确地评估链内二硫键的还原情况，作者模拟了不同氧化还原态的贝伐珠单抗轻链19+电荷态的同位素分布情况。如图3A，从上到下分别是模拟的完全还原（4 x SH）、部分还原（SS + 2 x SH）以及未还原（2 x SS）同位素分布。将实验测得同位素分布与模拟的同位素分布进行比对，计算每种氧化还原形式对总信号的贡献占比（图3B）。经过比对发现在1000 mV的电化学还原下是可以实现链内二硫键的完全还原的。因此，最终电化学还原设置为1000 mV。链内二硫键的完全还原可以极大的提高肽链的碎裂效率，获得更加丰富的MS/MS数据用于序列匹配。如图4所示，贝伐珠单抗以及西妥昔单抗的轻链19+电荷态被分离并碎裂。可以看到当施加1000 mV还原电势在质谱分析的前端时，轻链的二级碎片明显增加，特别是横跨链内二硫键的区域（图4，黄色阴影）。此外，在质量匹配的过程中也可以观察到二硫键处于还原状态，考虑还原氢引起的质量增加可以实现更多二级碎片的匹配。图3. A）不同氧化还原态的贝伐珠单抗轻链19+电荷态的同位素分布模拟；B）不同实验条件下的二硫键还原情况图4. MS/MS数据评估链内二硫键的还原情况总之，本文开发了一种在线电化学还原方法能够实现免疫球蛋白链间/链内二硫键的完全还原。该方法能够简化蛋白样品的前处理过程，方便后续的质谱测定。与之前的电化学反应器相比，该系统能实现链内二硫键还原的主要原因可能有以下几点：1、电化学流通池所用的表面材料，之前是全钛的设计，现在是表面镀铂。2、之前是三电极配置（工作电极，参比电极，辅助电极），而现在的设计减少至两个电极，驱动还原的电势适用于这种调整后电极配置。3、补充液的条件（50%乙腈和1%甲酸）对还原有利。此外，该电化学系统仍有需要改进的地方，例如：电化学反应池的体积过大、还原电势过高会影响质谱检测的信噪比等。该方法具有广阔的应用前景，无论是在蛋白质组学还是在结构质谱分析中。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins参考文献1.Vanduijn MM, Brouwer HJ, Sanz de la Torre P, Chervet JP, Luider TM. Online Electrochemical Reduction of Both Inter- and Intramolecular Disulfide Bridges in Immunoglobulins. Anal Chem. 2022, 94(7): 3120-3125. 2.Nicolardi S, Deelder AM, Palmblad M, van der Burgt YE. Structural analysis of an intact monoclonal antibody by online electrochemical reduction of disulfide bonds and Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal Chem. 2014, 86(11): 5376-5382.3.Trabjerg E, Jakobsen RU, Mysling S, Christensen S, Jørgensen TJ, Rand KD. Conformational analysis of large and highly disulfide-stabilized proteins by integrating online electrochemical reduction into an optimized H/D exchange mass spectrometry workflow. Anal Chem. 2015, 87(17): 8880-8888.

目前，肿瘤学已经上升到基因组分析的前沿，它可以被用于识别驱动突变和其他标记， 临床医生也可以借此设计疗法，监测病人的反应，而突变和标记可以通过NGS技术(第二代测序技术，一个生成gigabases数据的大规模平行测序技术)显现出来。 　　何为NGS?它面临着哪些问题? 　　NGS已经成为一个研究平台，虽然在科学和技术领域迅速获得认可，但就管理和实践层面，仍面临着许多障碍要跨越，包括相关规定，临床方针(ASCO NCCN等)方面的合并，报销，以及医生和病人对它的认知问题。 　　因此，如果个性化肿瘤学的潜力被意识到，NGS技术被诊所完全接受，利益相关团体就必须建立一个共同承诺，最近在山景城举行的个性化医疗世界会议上，部分发言人提出了此观点。 　　发言人之一John Leite是Illumina公司肿瘤市场开发和产品管理副总裁。Leite博士强调：需要同所有肿瘤团体的利益相关者达成一些共识，如什么样的产品最符合市场需求，开发这些临床应用产品所需的资料支持，以及医生和病人的诉求等等。这些利益相关者包括监管机构，宣传组，购买者和科学家。 　　&ldquo 对许多利益相关者而言，要他们采用NGS的解决方案，就需要临床数据来证明这些方案的价值，&rdquo Leite博士补充说。 &ldquo 如果要评估病人治疗结果的改变，临床试验将是最优的临床数据的生成机制。&rdquo 　　何为液体活检?为何要选择液体活检? 　　Mark Erlander博士说：&ldquo 一个成长中的肿瘤会不断释放坏死的细胞，喷洒它的基因物质，它们会进入血液和尿液，因而 我们使用精密癌症患者监控平台(PCM)，即利用尿液进行非侵入式的癌症检测，监测式的液体活检。&rdquo 　　&ldquo DNA正在极度退化中。中等长度的DNA在等离子体中约为145 - 150 bp，在尿液中约为75 &ndash 100bp。 即便你拥有DNA样本序列是支离破碎的也没有关系，只要它还存在，就可以通过NGS进行检测。 我们的突变等位基因浓缩技术可抑制野生型等位基因的放大，从而致使突变序列扩增，把绝大多数的野生型基因变成完全的突变序列。&rdquo 　　驱动突变可预测患者是否会对特定的治疗做出反应。Erlander博士提到：&ldquo 我们关注疾病的第四阶段的，因为这阶段是分子靶向药物首次进行大规模人群实验，这也是对病人而言最可怕的事情。 &rdquo 变异监测可以确定病人实际的反应。 　　在在一个前瞻性双盲实验中，PCM从组织细胞疾病患者身上探测到了BRAFV600E突变，收集到的数据包括测对BRAF抑制剂和抗治疗突变的反应。当细胞组织切片的肿瘤含量低并含有高基质污染的时候，通常检测较为困难，此时液体活检的潜力也就凸显出来了。 　　为什么ctDNA如此火热? 　　Erlander博士认为，循环肿瘤DNA(ctDNA)成为长期研究的热点有两个关键原因：一是ctDNA可以通过非侵入性测试被检测。 二是癌症的复杂多变性，癌症细胞会不断增殖克隆，但有一个问题，当血液尿液提供的扫描影响显示癌症患者已经开始扩散的时候，你会选择哪一种活检? 　　Erlander博士还表示：&ldquo 最近，Illumina公司的解决方案被应用于肿瘤学ctDNA分析领域，十分令人兴奋。循环肿瘤DNA(ctDNA)，除了可以作为分子标志物以外，重复进行ctDNA试验还可以用于检测治疗效果，阐明耐药性产生的机制，确定进一步治疗方案。循环肿瘤DNA为诊断试验提供了可靠的材料，从而弥补了组织缺少的不足。ctDNA分析的敏感性和精确度很高，足以进行肿瘤负荷的监测，包括微小残留病灶和抵抗性产生机制的鉴定，监测新生的疾病和新抗治疗突变。&rdquo 　　赛默飞世尔肿瘤学业务副总裁、总经理Mike Nolan表示，他们的公司负责分销Cynvenio Biosystems公司的用于血流中肿瘤标志物基因组分析的液态切片(LiquidBiopsy)。他认为赛默飞的Ion Torrent测序平台可补充PGM工作流程，仅用一小管血液便可分析游离DNA和血液循环肿瘤细胞，从而为客户提供一个基因组样品数据的解决方案。 　　免疫组库测序技术　　适应生物技术血液学产品的高级副总裁兼总经理Tom Willis博士说：&ldquo 我们免疫组库测序技术NGS平台能够适用于所有的T 细胞和B细胞癌症，不管包含什么样的致瘤突变。该平台覆盖面很广泛，因为它针对的是癌细胞的免疫细胞受体，而不是癌症突变本身。&rdquo 　　免疫组库测序(Immune Repertoire sequencing(IR-SEQ))是以 T/B 淋巴细胞为研究目标，以多重PCR或5&rsquo RACE技术目的扩增决定B细胞受体(BCR)或T细胞受体(TCR)多样性的互补决定区(CDR区)，再结合高通量测序技术，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系。 　　&ldquo 我们依赖于免疫细胞，包括致癌的免疫细胞，这些所谓的免疫细胞受体序列对每个正常T细胞或B细胞而言本质上是独特的，&rdquo Tom Willis继续说道， &ldquo 肿瘤由T细胞或B细胞的克隆扩张组成，并且很有可能在你排列材料的时候，它已经开始癌细胞的超高频克隆。&rdquo 　　ClonoSIGHT是实验室开发的监控最小残余疾病(MRD)的测试程序，一个预处理样品，典型的病理学实验室标本，通常用于识别超高频克隆的序列，然后用那些序列数据是来跟踪治疗后的低频克隆，探测血液或骨髓中的MRD。 　　Tom Willis博士指出：&ldquo 这种方法的好处之一是这些序列的独特性，经鉴定它们长约100 bp，因此，即使新的突变出现，正如经常发生的那样，这个方法也能很快识别新的序列并且跟踪它。&rdquo 　　重点癌症中心和制药公司用ClonoSIGHT进行临床试验。 &ldquo 它显然要比流式细胞术更敏感，它可以用于更多种类的标本，&rdquo Tom Willis补充道。 　　关于Adaptive收购Sequenta 　　最近Adaptive公司收购Sequenta让整个行业很兴奋。合并后公司表示，此举预计将加速新型免疫测序产品的使用，进一步发展对感染性疾病、自身免疫性疾病和癌症进行诊断和治疗。 　　Adaptive和Sequenta两家公司，均在免疫研究领域有着一定的影响力。并且，两家公司进行的检测都不需要长期支付昂贵的检测费用，也无需保险公司支付数百美元的保险费。从长远来看，两家合并后能惠及数百万计的传染病患者、自身免疫性疾病患者以及肿瘤患者。两公司的技术服务将有助于疾病的早期诊断和疗效监测。 　　大数据管理的优势 　　NGS的特点之一是大数据的生成，大数据是一个流行词，指的是大型、复杂的，难处理的数据组。 NGS和大数据齐头并进，传统的基因组学计算设施已经跟不上pb级别的序列数据。基因大数据 　　GenoLogics的CEO Michael Ball说：&ldquo 清晰实验室信息管理系统(LIMS)是一种确保实验室高效顺畅运行的基础设施， NGS的样品制备过程非常复杂，引入NGS到临床实验室带来的重要挑战包括会议监管需求CLIA，CAP和美国的HIPAA和国际ISO， LIMS通过工作流的强制执行，阳性样品的跟踪和数据安全可以满足这些需求，它告诉你病人样本的一切信息&mdash &mdash 从它进入实验室开始它发生了什么，它是如何处理的。 LIMS还可以确保样品绝不会和实验室的其他任何东西混合。&rdquo 　　Ball称：&ldquo 我们还可以把我们软件中的每个步骤都实现虚拟自动化。 例如，我们可以设计搬运液体的机器人取缔人工交涉，从而减少潜在错误。我们的独特功能之一是构建同时满足研究和临床需求的软件系统，这是至关重要的，因为事实上几乎NGS的临床实验都包含研究的部分，并且跟踪需求是非常困难的。&rdquo 例如，研究和临床环境分别强调的是灵活性和法规遵从性。 　　&ldquo NGS大数据的一部分问题是组织管理，确保你不会失去任何东西，并且知道关于样本的所有细节&mdash &mdash 每个序文件，每个序列分析，&rdquo Ball继续说，&ldquo 显然我们的LIMS软件提供了这样的接口让你知悉一切的进展。一些客户要求我们的LIMS实现云计算，提供了一个可伸缩的方式来增加存储容量。 在云中，很容易便可访问到大量的计算资源。&rdquo 　　Willis博士对Adaptive的临床做了描述，对大数据战略做了研究，结果如下：&ldquo 大数据在免疫组库测序临床方面的问题已经在我们的软件管道中解决了。 我们构建的完整的解决方案，可以让患者样本在生成和处理序列数据的过程中去到任何地方，针对医生MRD形式的报告进行强有力的临床回答。&rdquo 　　&ldquo 我们的免疫组库测序分析仪是一种强大而直观的云计算软件，使他们能够以多样的方式访问、处理以及分享他们的原始大数据。&rdquo 　　Mike Pellini医学博士，基础医学的总裁兼首席执行官表示，他的公司利用的是FoundationCore，一个包含35000多名病人的病例的标准化综合资料的数据库。大数据把细胞按照FoundationOne和FoundationOne血红素综合基因组分析NGS测试来分类，然后检测病人的实体肿瘤和血癌的分子驱动。 　　公司的互动癌症探测门户ICE2，旨在使医生能够利用基础医学测试来提高病人护理的效率，从而加强全面基因组分析的实用性， ICE2利用FoundationCore在 PatientMatch&trade 中起着重要作用，它增加了测试的可控诉情形。 使用PatientMatch，医生可以联系其他用相似的基因/肿瘤资料来治疗患者的医生一同分享治疗方法和结果信息。 　　商业伙伴关系 　　Mike Nolan表示，癌症是一个劲敌，然而通过合作伙伴模式可以共同进步，我们可以开发更好的解决方案，加快他们运送到社区的速度，包括患者、护理提供者和研究人员，NGS计划的力量是很明显的，离子激流技术生成的成千上万的结果都是最好的证明。 　　我们与葛兰素史克和辉瑞的合作将推动NGS肿瘤学测试通过监管当局向前发展，进入本地交付医疗网络，大约80%的癌症患者在那里进行治疗。第一个测试将在我们的离子PGM DX平台上开发使用离子AmpliSeq放大技术，它将合并我们从Oncomine研究小组选定的内容，其中包括超过100个癌症基因的同步检测单核苷酸变异，插入或缺失，拷贝数变异，和基因融合。 　　参考阅读：NGS Propels Personalized Oncology

超高效液相色谱/电喷雾串联质谱(UPLC/MS/MS)分析16种磺酰脲除草剂 蔡麒、黄静、Yap Swee Lee 沃特世科技(上海)有限公司 介绍 磺酰脲类除草剂品种的开发始于70年代末期。1978年Levitt 等报道,氯磺隆(chlorsulfuron)以极低用量进行苗前土壤处理或苗后茎叶处理,可有效地防治麦类与亚麻田大多数杂草。紧接着开发出甲磺隆，随后又开发出甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、苯磺隆、阔叶散、苄嘧磺隆等一系列品种。磺酰脲类除草剂由芳香基、磺酰脲桥和杂环三部分组成，在每一组分上取代基的微小变化都会导致生物活性和选择性的极大变化。 磺酰脲类除草剂的活性极高，属于超高效除草剂。这类除草剂用量很低，其用药量由传统除草剂的公斤级降为以克为单位。此类除草剂发展极快，已在各种作物地使用，有些已成为一些作物田的当家除草剂品种。而且，新的品种还在不断地商品化。 随着除草剂的大量应用和新品种的不断开发，带来了相应的环保问题。主要表现为除草剂的毒性问题、残留问题、生态问题、环境污染等问题。由于磺酰脲类农药的高效性，微量即可产生良好除草效果，但若使用不当就会对环境和其他作物产生危害。有些磺酰脲类除草剂的品种，如氯嘧磺隆、绿磺隆、甲磺隆、胺苯磺隆等在土壤中主要通过酸催化的水解作用及微生物降解而消失，土壤的温度、pH值、湿度、有机质含量对水解作用及微生物降解均有很大影响。 本文介绍了使用沃特世公司超高效液相色谱(UPLC® )和串联质谱(MS/MS)分析16中磺酰脲除草剂的分析方法。 2004年沃特世(Waters® )推出的ACQUITY UPLC® ，使用了具有1.7&mu m 颗粒粒径固定相的色谱柱，可以在高压下使用(最大压力 15,000 psi）。高压与极细颗粒的结合提供了快速、高分离度的分离，提高了灵敏度，减少了基质干扰。 2008年沃特世推出的Xevo TQ MS是新一代的串联四极杆质谱，改进了离子源的设计，改善了离子化效率，提高了灵敏度。Xevo TQ MS由于采用了专利的Scanwave技术和MS、MS/MS快速切换技术，大大改善了传统四极杆在进行MS Scan和Daughter Scan灵敏度低的问题，并且增加了实验选择性。 使用UPLC/Xevo TQ MS分析16种磺酰脲除草剂方法仅需要6分钟，而常规HPLC分析时间需要超过40多分钟的，因此UPLC更快的运行速度不仅提高了仪器的高通量，也减少了方法的开发时间。 超高效液相色谱ACQUITY UPLC 以及新一代串联四极杆质谱仪Xevo TQ MS 实验部分 色谱条件 系统： ACQUITY UPLC 超高效液相色谱系统 色谱柱： ACQUITY UPLC BEH C18,1.7um, 2.1x50mm P/N: 186002577 流动相A： 10mM AcNH4&bull H2O (含0.1%甲酸) 流动相B： 乙腈（含0.1%甲酸） 流速： 0.5mL/min 柱温： 35 ˚ C 进样体积： 5 µ L 分析总周期： 6 min UPLC梯度 质谱条件 MS系统： Xevo TQ MS 串联四极杆质谱仪 离子化模式: ESI+ 毛细管电压： 1.0Kv 源温度： 150 ˚ C 雾化气温度： 450 ˚ C 雾化气流速： 800L/h 锥孔气流速： 50L/h 碰撞气流速： 0.18ml/min 多反应监测条件如表1所示 表1：ES+模式下16种磺酰脲除草剂MRM离子对参数 结果和讨论 图1给出了16种磺酰脲除草剂在UPLC中的分离色谱图。6分钟可以完成16种磺酰脲除草剂的分析，与普通 HPLC 40min-50min 的分析时间相比，缩短了将近7倍，大大增加了实验室样品的通量，同时节约了试剂成本和人力成本。分析时间大大缩短的同时，仍然保留了高效的分离能力。从TIC色谱图上可以得到14种基线分离的色谱峰，另外两种由于极性相似度非常高，没有基线分离，但是通过质谱MRM通道可以完全分开，因此本方法在寻求快速分析的同时，兼顾了色谱分离的要求，降低基质影响的效果。 图1：16种磺酰脲除草剂TIC图 图2，图3给出了具有代表性的卞嘧磺隆(Bensulfuron)和环氧嘧磺隆(Oxasulfuron)在浓度范围1-200ng/mL的标准曲线，本标准曲线是用溶剂空白以及相应浓度标准检测绘制的。图 2. 卞嘧磺隆(Bensulfuron)标准曲线 表 3. 环氧嘧磺隆(Oxasulfuron)标准曲线 表2给出的是16种磺酰脲除草剂1ppb的信噪比(Peak to Peak)和 1，5，10，50，200ng/ml的线性相关系数。 表2. 磺酰脲除草剂的1ppb信噪比和线性相关系数 图4给出的是最低检测限浓度(0.01ng/ml)附近的化合物谱图。从分析结果来看，仪器的标准检测限除苯磺隆外基本可以达到0.01ng/mL甚至更低。 图4. 16种磺酰脲除草剂0.01mg/mL谱图 结论 ACQUITY UPLC系统提高了磺酰脲除草剂分析的选择性和灵敏度，同时运行时间显著缩短。现在科学工作者们已经跨越了传统HPLC限制的障碍，可以使用UPLC将分离化学延伸和扩展到更多应用中。