酪氨酸环氧化物

“世界心脏日今天9月29日是世界心脏日(World Heart Day)，是由世界心脏联盟确定，旨在世界范围内宣传有关心脏健康的知识，并让公众认识到生命需要健康的心脏。在全世界范围内，心血管疾病是威胁人类健康的高危病种，其危害无年龄、身份、地域之分。在中国，每年大约有260万人死于心脑血管疾病，死亡人数位列世界第二。《中国心血管健康与疾病报告2021》指出，每5例死亡中就有2例死于心血管病。急性心肌梗死(MI)是一种常见的由突发冠状动脉血栓形成和闭塞引起的心脏急症。急性心肌梗死期间持续的缺血组织损伤导致疤痕形成，进而可能心力衰竭。心肌梗死后形成的新血管可减轻疤痕和心功能恶化。然而心肌梗塞后形成血管生成和功能适应的细胞间的相互作用仍不完全清楚。下面跟随小编来看一下德国汉诺威医学院的研究人员今年发表在《Science》上的“心脏知识”。德国汉诺威医学院Kai C. Wollert研究团队发表题为Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase的研究。通过对急性心肌梗死的小鼠进行生物信息学分泌组分析，发现细胞因子METRNL(Meteorin-like) 在梗死边界区内皮细胞高度表达，促进心肌梗死后的血管生成、组织修复和功能适应。使用化学交联质谱法发现，KIT（受体酪氨酸激酶）是内皮细胞中METRNL细胞表面受体。为了评估METRNL是否与KIT的细胞外结构域结合，通过微量热泳动（MST）技术，检测到KIT-ECD-Fc可结合METRNL和SCF（KIT已知配体），并且亲和力很高（Kd分别是87nM和175nM）,而不与血管内皮生长因子A(VEGFA)结合。Pull Down实验获得相同的结果。图注：MST技术和Pull Down检测KIT的胞外结构域与METRNL，SCF和VEGFA结合随后，作者检测时发现METRNL的治疗会增强心肌梗死区域边缘的毛细血管化，限制瘢痕的形成并对心脏功能具有持续有益的影响。研究结果: 作者定义了一种基于METRNL的髓系细胞和内皮细胞之间的交叉信号，METRNL通过KIT依赖的信号通路介导内皮细胞的血管生成作用促进心肌梗死后组织修复，为急性心肌梗死的治疗提供了新的药物靶点。心脏是人体最重要的器官之一，无论工作或者科研再忙碌，一定要注意休息。马上就要国庆节了，让我们一起为劳苦功高的心脏放个假吧！文献参考：Reboll, Marc R., et al. "Meteorin-like promotes heart repair through endothelial KIT receptor tyrosine kinase." Science 376.6599 (2022): 1343-1347.*文内部分图片来源自百度，侵则删。

01前言Thermal shift assay（TSA），也被称为差示扫描荧光法（DSF）是表征蛋白热稳定性的常用方法之一，广泛应用于蛋白配体互作表征，突变体、缓冲液、去垢剂筛选等领域。但DSF的实验操作较繁琐，需要根据蛋白的特性及去垢剂兼容性选择合适的染料，优化蛋白和染料的比例，在配制样品时还要考虑染料自带的有机溶剂对蛋白的影响。替代性技术：nanoDSF技术时下被行业深度认可的无标记的TSA验证方法-也称nanoDSF技术，可解决DSF技术的局限性，样品无需加染料就可以直接上机检测了。下面我们一起通过用户的文献案例来进一步了解。02NanoTemper用户应用案例解读检测样品：Cas9，gRNA使用仪器：PR系列蛋白稳定性分析仪涉及技术：nanoDSF技术https://doi.org/10.1016/j.isci.2023.106399CRISPER - Cas9介导的基因编辑能够帮助人们在动物和细胞模型中实现广泛的靶向敲除(KO)或敲入(KI)，例如单点或多点KO、点突变、报告基因KO或KI等。然而，CRISPR-Cas9的切割效果和准确性仍是基因编辑面临的主要挑战，它们特别受到核糖核蛋白复合物 (RNP)的组装配比的影响。2023年3月，法国南特大学的研究人员近期发表了研究成果：Excess of guide RNA reduces knockin efficiency and drastically increases on-target large deletions，作者借助PR系列蛋白稳定性分析仪搭载的nanoDSF技术，一种无需标记和固定化的方法，证明了Cas9和gRNA的等摩尔比是形成RNP复合物的最佳条件。研究结果作者通过CRISPR/Cas9 KI将双等位纯合子GFP hiPSCs转化为BFP表达细胞，通过细胞表型分析证明在Cas9的最佳浓度为0.4 mM时，增加ssODN浓度有助于降低KO率，提高KI率，而增加dgRNA对KO和KI没有影响。0.4 mM的Cas9、等摩尔Cas9/gRNA比例和2 mM的ssODN是在hiPSC中实现高效GFP到BFP转换的最佳选择。 在此之前，有一些研究曾表明过量的gRNA对于靶向切割有帮助，而本文作者的实验结果则与之产生了矛盾。于是作者使用NanoTemper公司的nanoDSF技术建立了一套体外实验方法学，用来评估RNP复合物的形成效率，从而佐证他们的结论。通过nanoDSF这种无标记技术，可在升温过程中检测蛋白中的色氨酸和酪氨酸的自发荧光。随着升温，仪器同步采集在350 nm和330 nm处的最大发射光位移，并自动拟合出蛋白的热展开曲线。NanoDSF能够检测蛋白的构象变化导致的热稳定性差异，并由熔解温度(Tm)来表征蛋白的热稳定性。由于Cas9是一种含有色氨酸和酪氨酸残基的变构酶， 因此利用nanoDSF技术可以简单、直观地检测导致Cas9重排的RNP复合物的形成。 为了确定hiPSC中使用的dgRNA靶向GFP位点(dgRNA GFP)形成RNP复合物的有效性，作者使用恒定浓度的Cas9 (0.75 mM)与一定浓度范围内的dgRNA, 通过nanoDSF检测，作出升温诱导的蛋白变性曲线检测 (图1A)。根据一阶导数，可以确定Cas9单独的Tm(TmCas9 = 43.2C)，以及Cas9/dgRNA摩尔比为1/1至1/5 的Tm：1/1 时TmRNP = 49.6 C、1/2 时TmRNP = 50.0 C、1/3时 TmRNP = 49.9C、1/5 时TmRNP = 49.8 C (图1B)。相比只有Cas9时， Cas9/dgRNA摩尔比为1/1至1/5 时的Tm都有明显增加，但Cas9/dgRNA不同摩尔比之间的Tm并没有显著差异（图1C）。这反映了RNP复合物的形成情况。另外，当Cas9/dgRNA为等摩尔比时，是检测不到游离Cas9的。因此，可以认为Cas9/dgRNA等摩尔比是形成RNP复合物的最优条件。图1作者在大鼠胚胎上使用点突变模型来验证等摩尔Cas9/dgRNA是否能得到最佳的KI率，以及过量的dgRNA是否会影响KI效率。 他们先使用nanoDSF检测大鼠胚胎中Cas9过量、等摩尔Cas9/dgRNA或dgRNA过量这几种情况下，RNP复合物的形成情况(图2A)。在所有条件下，添加dgRNA靶向的环氧化物水解酶2基因(dgRNA rEphx2)，与单独Cas9相比，Tm都显著增加，表明RNP复合物的形成 (图2B)。 在Cas9/dgRNA摩尔比为 5/1和2/1时，可以看到变性曲线中包含了两个热变性峰，分别可表示为TmCas9和TmRNP。与单独Cas9相比(TmCas9 = 43.2℃)， TmCas9对这两种RNP的比例差异不显著(TmCas9 RNP 5/1 = 43.0℃ TmCas9 RNP 2/1 = 43.3℃, p分别= 0.4809和0.9353)，而TmRNP为(TmRNP RNP 5/1 = 48.0℃ TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃, p 都= 0.029)。这些结果表明，在两个条件下，RNP复合物已经形成，而游离Cas9仍然存在。当等摩尔比(RNP 1/1)或dgRNA rEphx2过量(RNP 1/2, 1/3和1/5)时，只观察到一个热变性峰(TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃ TmRNP RNP 1/2 = 49.9℃ TmRNP RNP 1/3 = 49.8℃ TmRNP RNP 1/5 = 49.7℃)，这些Tm之间差异不显著。此外，与dgRNA rEphx2相比，RNP 1/1比例的TmRNP与RNP 2/1比例的TmRNP显著不同(TmRNP RNP 2/1 = 48.9℃ TmRNP RNP 1/1 = 49.7℃, p = 0.0206)，与单独Cas9也显著不同 (TmCas9 Cas9 = 43.2℃ TmRNP RNP 1/1 = 49.7C, p03关于PR系列蛋白稳定性分析仪德国NanoTemper公司自2014年推出PR系列蛋白稳定性分析仪，以nanoDSF技术为核心，通过检测蛋白内源荧光，无需标记即可检测蛋白Tm值，快速精确评估蛋白在不同条件下的热稳定性变化。2020年NanoTemper推出新一代PR Panta仪器，并于2022年整合四大技术模块nanoDSF/Backreflection/DLS/SLS，可实时同步评估蛋白热稳定性，胶体稳定性，聚集体与粒径等信息，为科研人员在蛋白质量控制、复合物分析、化合物筛选、制剂优化等方面提供强大助力。今年年初，公司凭借自身不断创新的科学技术，推出新品型号：PR Panta + 机械臂自动上样器，这款新品拥有独立且包罗万象的系统，包含机械臂、外框架、计算机和监视器。可装载多达4个384微孔板，用于检测所有蛋白质候选分子热变性、胶体稳定性和化学变性的全自动操作。可针对高通量或配方筛选实验场景，无需手动即可完成多达1536个样品的检测。PR系列产品

摘要 　　“十二五”期间，氮氧化物的总量控制要突出重点行业和重点区域，推行以防治火电行业排放为核心的工业氮氧化物防治体系和以防治机动车排放为核心的城市氮氧化物防治体系。要推进能源结构持续优化，严格控制新增量 全面开展电力行业氮氧化物减排 采取综合措施加强机动车氮氧化物排放控制 推进以水泥行业为主的其他行业氮氧化物排放控制。 　　2011年3月14日，全国人大审议通过了“十二五”规划纲要，提出化学需氧量、二氧化硫分别减少8%，同时将氨氮和氮氧化物首次列入约束性指标体系，要求分别减少10%，氮氧化物已经成为我国下一阶段污染减排的重点。 　　把氮氧化物作为“十二五”减排约束性指标的必要性 　　■阅读提示 　　由氮氧化物等污染物引起的臭氧和细粒子污染问题日益突出，威胁人民群众的身体健康，成为当前迫切需要解决的环境问题。若不加严控制，今后一段时期我国城市光化学烟雾、酸雨污染和灰霾天气还将呈迅速发展和恶化之势。 　　氮氧化物活性高、氧化性强，是造成我国复合型大气污染的关键污染物。随着国民经济持续快速发展和能源消费总量大幅攀升，我国氮氧化物排放量迅速增长。“十一五”期间，我国氮氧化物排放量逐年增长，2008年达2000万吨，排放负荷巨大。火力发电、工业和交通运输部门三者之和占我国氮氧化物排放总量的85%，基本呈现三足鼎立之势。氮氧化物排放量的迅速增加导致了一系列的城市和区域环境问题。北京到上海之间的工业密集区已成为对流层二氧化氮污染较为严重的地区，“十一五”期间全国降水中硝酸根离子平均浓度较2005年有较大幅度增长。由氮氧化物等污染物引起的臭氧和细粒子污染问题日益突出，威胁人民群众的身体健康，成为当前迫切需要解决的环境问题。若不加严控制，今后一段时期我国城市光化学烟雾、酸雨污染和灰霾天气还将呈迅速发展和恶化之势。综上分析，“十二五”期间我国必须对氮氧化物进行全面控制，针对氮氧化物的污染特征，进入以质量改善为切入点、以主要行业为突破口的大规模削减阶段。 　　从减排管理的基础条件来看，自“十一五”以来，随着污染减排三大体系能力建设的加强，氮氧化物统计、监测管理工作取得突破性进展。2006年全国环境统计中将氮氧化物因子纳入到环境统计范畴 2007年开展的污染源普查工作对全国氮氧化物排放系数和排放现状进行了全面调查。在污染源监测方面，随着国控重点源烟气排放连续监测设施建设完成，氮氧化物排放重点源大都具备了自动监测的能力，并与省、市监控中心实现了联网。此外，国内火电行业氮氧化物控制技术日趋成熟，除催化剂等核心技术外，基本实现了国产化。这些都为全面实施氮氧化物排放总量控制奠定了良好的基础。 　　“十二五”氮氧化物总量控制总体考虑及目标的确定 　　■阅读提示 　　在确定国家总量控制目标的同时，也将减排任务分解到了各省(自治区、直辖市)，确定了减排项目清单，真正把减排任务落到实处，这是总量控制目标制定的一次突破。 　　污染物排放总量控制是环境管理的重要手段，我国氮氧化物的总量控制模式要根据排放物的污染特征来确定，氮氧化物排放具有行业、区域集中的特点，因此，“十二五”期间氮氧化物的总量控制要突出重点行业和重点区域，推行以防治火电行业排放为核心的工业氮氧化物防治体系和以防治机动车排放为核心的城市氮氧化物防治体系。强化总量控制对经济发展方式、经济结构调整和能源结构调整的优化作用，严格控制增量，强化结构减排，细化工程减排，实化监管减排，确保减排约束性指标目标的完成。 　　值得一提的是，此次在总量控制目标确定方面，我国首次采用了“二上二下”的方式。通过印发《“十二五”主要污染物总量控制规划编制指南》(以下简称《指南》)，提出了“十二五”氮氧化物减排的总体思路、减排要求、减排技术路线及总量目标测算方法，各省结合本省的环境质量状况、经济社会发展情况及减排潜力，根据《指南》要求编制总量控制规划，测算总量控制目标，提交减排项目清单。在此基础上，统筹考虑国家宏观经济政策、节能减排重大战略、产业布局和结构调整要求，确定国家总量控制目标，实现了统筹协调、上下衔接、部门联动，增强了总量控制目标确定的科学性、合理性和可行性。在确定国家总量控制目标的同时，也将减排任务分解到了各省(自治区、直辖市)，确定了减排项目清单，真正把减排任务落到实处，这是总量控制目标制定的一次突破。 　　“十二五”氮氧化物总量控制基本思路 　　■阅读提示 　　推进能源结构持续优化，严格控制新增量 全面开展电力行业氮氧化物减排 采取综合措施加强机动车氮氧化物排放控制 推进以水泥行业为主的其他行业氮氧化物排放控制。 　　推进能源结构持续优化，严格控制新增量。严格执行国家产业政策，全面落实淘汰落后产能要求，在单位面积排放强度大的地区要进一步加严产业结构调整要求，遏制高耗能、高污染产业过快发展。严格控制污染物新增量。新建项目必须按照先进的生产技术和最严格的环保要求进行控制，大幅度降低污染物排放强度。煤电及水泥行业新建项目要求配套建设烟气脱硝设施。提高机动车准入门槛，执行国家第Ⅳ阶段排放标准，部分城市提前执行国家第Ⅴ阶段排放标准，供油油品实现配套。进一步改善能源消费结构，控制煤炭消费增量，促进经济发展的绿色转型。 　　全面开展电力行业氮氧化物减排。电力行业属于高架源，排放的氮氧化物在大气中发生远距离传输和化学转化，不但会影响当地的环境质量，而且存在跨界污染的问题，是造成区域性环境问题的主要原因。截至目前，我国已有80%的火电机组采用了低氮燃烧技术，已建烟气脱硝设施达到9700万千瓦。目前我国正在修订火电厂大气污染物排放标准，氮氧化物的排放标准将会非常严格。这就要求在“十二五”期间，除淘汰的小火电机组外，全面推进现役机组低氮燃烧技术改造及脱硝设施的建设，加大已安装脱硝设施机组的监管力度，提高减排能力。东部地区和其他地区的省会城市单机容量20万千瓦及以上的现役燃煤机组实行脱硝改造，其他地区单机容量30万千瓦及以上的现役燃煤机组实行脱硝改造。 　　采取综合措施加强机动车氮氧化物排放控制。在一些大城市，机动车排放已经超过工业排放成为重要的大气污染源，氮氧化物的分担率一般在50%左右，由于其排气高度低，对人体的危害非常大，因此机动车氮氧化物的控制对改善城市环境质量具有至关重要的作用。“十二五”期间我国将在有条件的重点城市实行机动车新增量总量控制，并严格执行黄标车淘汰政策。按照东、中、西部差别化的政策，加大黄标车的淘汰力度，到“十二五”末，东部地区基本淘汰所有黄标车，即国0的汽油车和国Ⅲ以前的柴油车。提高机动车准入门槛，实施油品升级改造工程。“十二五”期间，在全国范围内严格实施国家第Ⅳ阶段机动车排放标准，部分重点区域和城市提前实施国家第Ⅴ阶段排放标准 2011年在全国范围内供应国Ⅲ标准的车用燃油，2015年底前基本实现国Ⅳ水平车用燃油的供应，实现车、油同步升级。 　　推进以水泥行业为主的其他行业氮氧化物排放控制。我国水泥行业氮氧化物的排放占总排放量的10%左右，是我国氮氧化物排放的第三大源。随着水泥行业落后产能淘汰工作的推进，新型干法窑的使用比例将大幅增加，在提高能源使用效率的同时，由于燃烧温度高等原因，氮氧化物排放量将显著增加。“十二五”期间需大力开展水泥行业新型干法窑降氮脱硝工作，根据水泥窑的现状和特性，推进烟气脱硝工程建设，要求长三角、珠三角、京津冀鲁等重点区域氮氧化物年排放量在1000吨以上或熟料生产规模在2000吨/日以上的现役新型干法窑实行脱硝改造。 　　钢铁、工业锅炉也是氮氧化物的重要排放源，为拓展氮氧化物减排领域，推进氮氧化物持续减排，“十二五”期间应加快冶金行业、工业锅炉等其他行业氮氧化物控制技术的研发和产业化进程，推进烟气脱硝示范工程建设。 　　“十二五”氮氧化物总量减排的难点 　　■阅读提示 　　电力行业大规模脱硝受多种因素的影响和制约 油品质量保证和机动车排放标准实施进程直接影响到氮氧化物的减排进展 重点行业污染治理技术的发展水平将影响“十二五”氮氧化物的减排效果。 　　电力行业大规模脱硝受多种因素的影响和制约。为实现氮氧化物“十二五”总量控制目标，“十二五”期间我国电力行业脱硝装机容量比例需达到70%以上(包括新增机组)，这将大于“十一五”期间二氧化硫的脱硫装机容量，减排压力非常大。此外，电厂脱硝还原剂氨的需求量将很大，脱硝装置中的催化剂也未实现国产化，这些因素都将增大电力行业氮氧化物减排的难度。 　　油品质量保证和机动车排放标准实施进程直接影响到氮氧化物的减排进展。车用燃油质量差、含硫量高是制约机动车排放控制的主要因素，尤其是当前柴油品质极不利于柴油机尾气后处理技术的使用，影响氮氧化物减排效果。目前我国还未实现国Ⅲ油品柴油的全面供应，这与“十二五”期间要基本实现国Ⅳ水平车用燃油的供应仍有较大差距，需要多部门加强协调推进这项工作。另外，提高机动车排放标准是控制机动车氮氧化物新增量的主要手段，但标准实施后减排效果需要一定的时间才能显现，因此，“十二五”期间国Ⅳ排放标准能否及时推行是保障机动车氮氧化物减排的关键。 　　重点行业污染治理技术的发展水平将影响“十二五”氮氧化物的减排效果。尽管我国已有电厂烟气脱硝的控制技术，但火电厂烟气脱硝的一些关键技术仍受制于国外，钢铁、水泥、工业锅炉等行业氮氧化物排放控制技术也处于研究阶段，其研发及应用的发展水平将影响“十二五”氮氧化物的减排效果。“十二五”期间，国家应该对氮氧化物控制技术研究及产业化给予更多的支持及优惠政策，尽快推动国内氮氧化物控制技术的规模化示范应用和产业化，为氮氧化物的大规模削减提供更多技术支撑。