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http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/11/201211201436_405528_2518341_3.jpg其一款婴儿奶粉在香港被查出生物素含量不达标,可导致婴儿脱发、皮疹等,香港食环署已建议停售,至此相关奶粉的事件已经成为常态新闻了,三聚氰胺、婴儿提早发育、还有婴儿脱发等等,这些让人触目惊心的新闻背后到底有多少不可告人的秘密?根据食环署近日公布的一份报告,明治细仔奶粉0-12个月(850克)的生物素含量只有0.81微克/100千卡,低于食品法典委员会标准。风险评估发现,如根据标签上的喂哺建议,其生物素摄入量将低于世界卫生组织建议的摄入量5微克/日。而另一款和光堂的初生婴儿奶粉为0.68微克/100千卡,同样低于食品法典委员会标准。食物安全中心发言人表示,膳食生物素缺乏症是非常罕见的,未曾在母乳喂养的婴儿出现。但是如果零至6个月大婴儿长期只单纯靠上述奶粉摄取生物素,不排除对健康有不良影响。生物素缺乏的婴儿可能会出现脱发、皮疹、肌肉张力低、嗜睡等症状。你家的孩子现在吃的是什么奶粉?奶瓶塑化剂事件刚过,奶粉生物素问题又来了,怎样才能给自己孩子的健康给一个安全的保障?奶粉中生物素含量应该怎么来测定?奶粉生物素含量国家标准有哪些?生物素的物性是什么?为什么会引起婴儿脱发?
[font=宋体][font=宋体]生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]亲和素系统 [/font][font=Calibri](biotin-avidin system[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]BAS)[/font][font=宋体],是[/font][font=Calibri]70[/font][font=宋体]年代后期应用于免疫学,并得到迅速发展的一种常用的生物反应放大系统。它具有高度特异性、敏感性、稳定性的特点,两者的亲和常数([/font][font=Calibri]K=1015 mol/L[/font][font=宋体])比抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体([/font][font=Calibri]K=105[/font][font=宋体]~[/font][font=Calibri]1011 mol/L[/font][font=宋体])至少高[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]万倍,是目前已知强度最高的非共价作用,这使得生物素标记的蛋白成为研究蛋白质相互作用和筛选抗体或小分子潜力药物的强大工具。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州开发了丰富的生物素标记蛋白产品,拥有[/font][font=Calibri]Avi-tag[/font][font=宋体]定点标记和化学标记两种类型的生物素标记蛋白,覆盖细胞治疗、抗体药、疫苗等热门靶点。产品具有高批间一致性、高活性等优势,适用于[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Biopanning[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]SPR / BLI[/font][font=宋体]等实验。下面为大家提供生物素蛋白标记常见问题及注意事项:[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]生物素蛋白标记常见问题:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、什么是生物素标记蛋白[/font][font=Calibri]?[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在生物化学中,生物素化蛋白质就是生物素与蛋白质等大分子物质共价结合的产物。生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]亲和素亲和常数至少比抗原[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]抗体高一万倍[/font][font=Calibri],[/font][font=宋体]是目前发现的自然界中具有最强亲和力的物质。因此,生物素[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]亲和素系统已被广泛地应用于免疫诊断技术。生物素化蛋白的出现,也为类似于[/font][font=Calibri]WB[/font][font=宋体]实验简化了流程,提高了效率。此外,由于生物素的小尺寸([/font][font=Calibri]MW = 244.31g / mol[/font][font=宋体]),不太影响蛋白质本身的天然功能。所以它同时具备了高亲和力、高特异性、高灵敏度的优点。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、生物素标记蛋白有哪些应用?[/font][/font][font=宋体][font=宋体]生物素标记蛋白广泛的应用在生物技术的众多领域。如透析,将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中,当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时,与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附,直接流出,从而与被分离的蛋白质分开,然后选用适当的洗脱液,[/font] [font=宋体]改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来。怎么释放所需蛋白呢?这需要非常严苛的条件(例如,[/font][font=Calibri]pH=1.5[/font][font=宋体]的 [/font][font=Calibri]GuHCl[/font][font=宋体]),这种极端条件下的蛋白是会变性的。如果需要分离标记的蛋白质,最好用亚氨基生物素标记的蛋白质。该种生物素在碱性条件下与抗生物素蛋白结合紧密,但是在降低[/font][font=Calibri]pH[/font][font=宋体]以后,亲和力降低。因此亚氨基生物素标记蛋白可以通过降低[/font][font=Calibri]pH([/font][font=宋体]约[/font][font=Calibri]pH=4)[/font][font=宋体]从柱子上释放。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]免疫检测中的应用:在常规[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]原理的基础上,结合生物素[/font][font=Calibri](B)[/font][font=宋体]与亲和素[/font][font=Calibri](A)[/font][font=宋体]间的高度放大作用,而建立的一种检测系统。生物素很易与蛋白质[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]如抗体等[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]以共价键结合。这样,结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应,既起到了多级放大作用,又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色,达到检测未知抗原[/font][font=Calibri]([/font][font=宋体]或抗体[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]分子的目的。 这可以用于通过荧光或电子显微镜定位的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]测定,[/font][font=Calibri]ELISPOT[/font][font=宋体]测定,[/font][font=Calibri]western[/font][font=宋体]印迹和其他免疫分析方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]生物素标记注意事项:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类(氨基、醛基或巯基)以及分子的酸碱性,选择相应的活化生物素和反应条件;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、标记反应时,活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例;生物素:[/font][font=Calibri]IgG [/font][font=宋体]用量比[/font][font=Calibri](mg/mg)[/font][font=宋体]宜为[/font][font=Calibri]2:1, IgG[/font][font=宋体]应用浓度[/font][font=Calibri]0.5~5[/font][font=宋体]μ[/font][font=Calibri]g/ml [/font][font=宋体]生物素[/font][font=Calibri]1~3[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/Ag[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]3~5[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]/Ab[/font][font=宋体];[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、为减少空间位阻影响,可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构;[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后,不影响后者的免疫活性;标记酶时则结果有不同。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多关于[url=https://cn.sinobiological.com/category/biotinylated-protein-elite][b]生物素标记蛋白[/b][/url]详情可以参看:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/category/biotinylated-protein-elite[/font][/font][font=宋体] [/font]
[size=16px]超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定奶粉中生物素的含量[/size][align=center][size=16px]户江涛[/size][/align][align=center][size=16px](黑龙江省农垦科学院测试化验中心,黑龙江 佳木斯 154007 )[/size][/align][size=16px]摘要:采用超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法建立了检测奶粉中生物素含量的分析方法,对试样提取、净化条件,流动相、色谱柱和质谱条件进行了优化,结果表明该方法与国标微生物法对同一样品检测得到的生物素含量基本一致,但检测所需时间大大减少,且抗干扰能力、精密度均比微生物法高,特别适和大批量奶粉中生物素含量检测。关键词:超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱;奶粉;生物素生物素又称维生素B7,是生物体内羧基转化酶作用的一种辅酶,在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。人类自身不能合成生物素,需从膳食中获得,而奶粉是人类(特别是婴幼儿)获取生物素的重要途径,准确测定奶粉中生物素含量有重要意义。目前国家标准规定的生物素测定方法《GB 5009.259-2016 食品安全国家标准 食品中生物素的测定》为微生物法。该方法需要购买特定菌种,成本较高,且菌种难保存、易受污染,实验操作复杂、费时费力、技术难度大、对检验人员和实验室要求较高,且容易受到基质干扰、检测结果重复性较差。同时奶粉成分复杂,所含生物素含量极低,一般为十几个微克/100克。因此,制定一种准确、高效、便捷、灵敏度高的生物素测定方法迫在眉睫。基于高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]的分离能力和质谱的高灵敏度、高选择性,采用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱测定法具有前处理简单、分析速度快,适用的基质范围广、实用性强,可以为奶粉中生物素含量的测定提供一种有效的检测手段。本文建立的超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定奶粉中生物素含量[color=black]的方法前处理过程简便、分析时间短、灵敏度高、抗干扰能力强,特别适用于大批量奶粉样品中生物素[/color]含量的检测。1 实验部分1.1 材料与试剂[color=black]生物素(纯度[/color][font=宋体][color=black]≥[/color][/font][color=black]99%,Sigma公司);婴儿配方乳粉定量分析质控样品(BQC1051147452,北京普天同创生物科技有限公司);乙腈、甲酸(色谱纯,Fisher公司);Prime HLB固相萃取柱(200 mg,3 mL,[/color][font=宋体]Waters[/font][color=black]公司);0.2 um有机系滤膜;实验用水为Millipore纯水仪制备。[/color]1.2 仪器与设备UPLC XEVO TQ-S超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]串联质谱仪(Waters公司);涡旋振荡器。1.3 [color=black]生物素[/color]标准储备液的配置称取一定量生物素[color=black]标准品[/color],用50%乙醇-水溶液配置成质量浓度为100 ug/mL标准储备液,于2~4℃冰箱保存(有效期1个月),待用;临用前将溶液回温至室温,并吸取一定体积储备液用水逐级稀释成所需浓度的标准工作液。1.4 样品前处理准确称取1.00 g(精确到0.01 g)奶粉试样于50 mL离心管中,加入10.00 mL纯水涡旋混匀2 min,然后加入10.00 mL乙腈,涡旋混匀1 min,然后在离心机中以15000 r/min离心5 min,取出后吸取2 mL上清液置于[color=black]Prime HLB固相萃取柱中,使其自然流出弃去最初几滴,然后用玻璃试管接取流出液约1 mL涡旋混匀,[/color]过0.22[font=宋体]u[/font]m有机系微孔滤膜后供UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS分析测定。1.5 [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]及质谱条件[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]:色谱柱:Waters HSS [font=times new roman]T3(1.8 μm,100mm×2.1mm);柱温:30℃[/font];流速:[font=times new roman]0.3 [/font]mL/min;进样量:[font=times new roman]2[/font] [font=times new roman]μL;流动相A:乙腈;流动相B:0.1%的甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0~0.5min,10% A;0.5~3. 0 min,10%~100% A;3. 0 ~4. 0 min,100%A,4 ~4.1min,100% A~10% A,4.1 ~5.0min 10% A。[/font]质谱:离子源:电喷雾离子源( ESI [sup]+[/sup] ) ;扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应监测( MRM);毛细管电压:3.2 kv;离子源温度:150℃;去溶剂气温度:500℃;去溶剂气流量:1000 L /h;定性、定量离子对及碰撞能量见表1。[/size][align=center][size=16px]表1生物素的质谱参数[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=16px]分析物[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]锥孔电压/V[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]母离子/(m/z)[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]子离子/(m/z) [/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]碰撞能量/V[/size][/align][/td][/tr][tr][td][size=16px]生物素[/size][/td][td][align=center][size=16px]30[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]245[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]227﹡[/size][/align][align=center][size=16px]97[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]13[/size][/align][align=center][size=16px]25[/size][/align][size=16px][/size][/td][/tr][/table][size=16px]﹡为定量离子2 结果与讨论2.1 色谱质谱条件及前处理过程的优化流动相的选择:对比了酸性体系(0.1%甲酸水溶液)与甲醇、乙腈的流动相体系组合,结果发现生物素在乙腈体系中响应值比甲醇更好一些,故本研究采用0.1%甲酸水溶液+甲醇流动相体系。色谱柱的选择:比较了[font=宋体]Waters [/font]BEH C[sub]18[/sub](1.7 μm,50mm×2.1mm)和[font=宋体]Waters [/font]HSS T[sub]3[/sub](1.8 μm,100mm×2.1mm)两种不同填料的分析柱,实验时发现目标物在这两款色谱柱上响应值差不多,但目标物在BEH C[sub]18[/sub]上保留时间比HSS T[sub]3[/sub]要短,考虑到生物素本身属于水溶性维生素,极性较强,若出峰太早可能造成奶粉中一些极性强的基质随目标物一起共流出进而干扰目标物测定,因此本方法采用了HSS T[sub]3[/sub]色谱柱。质谱参数优化:将1.0 mg/L 生物素标准溶液直接注射到质谱中,在正离子模式下进行母离子全扫描,发现目标物各自对应的准分子离子峰[M+H][sup]+[/sup]具有很好的响应,然后在分别进行子离子全扫描,各得到两对丰度高、干扰小的子离子对进行MRM监测,最终确定的质谱条件见表1,相应的色谱质谱图见图1、图2。前处理过程优化:生物素属于水溶性维生素,用纯水作为提取试剂可以得到很好的提取效果。但实验过程中发现,用纯水将奶粉溶解后整个溶液呈乳白色,只通过离心方式很难去除其中大量的蛋白、脂肪等杂质,需要对提取液进行除蛋白操作。通过考察乙酸铅、三氯乙酸、乙腈等几种常用的沉淀蛋白方法,综合考虑在去除蛋白的同时要尽可能减少其它杂质的引入,因此本方法采用乙腈除蛋白的方式,比较了几种不同水/乙腈比例,最终选定水/乙腈(1:1体积比)达到最优的实验效果。对于脂肪的去除则选用了目前较流行的[color=black]Prime HLB固相萃取柱通过式方法,即提取液通过Prime HLB时脂肪等大分子保留在SPE小柱上,目标物不保留以达到去除脂肪等杂质的目的,[/color]综合以上因素本实验最终采用了1.4的前处理方法。[/size][align=center][size=16px][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210071506558084_124_1729077_3.jpg[/img][/size][/align][align=center][size=16px]图1 [color=black]生物素[/color]标准溶液(10 ng/mL)MRM色谱图[/size][/align][size=16px][/size][align=center][size=16px][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2022/10/202210071506561980_1283_1729077_3.jpg[/img][/size][/align][align=center][size=16px]图2 奶粉样品中[color=black]生物素[/color]MRM色谱图[/size][/align][size=16px][color=black]2.2 线性范围和定量限[/color][color=black]吸取不同体积的生物素标准储备液(1.3),用[/color]纯水[color=black]分别配置不同浓度的[/color]上机标准溶液,以各自定量离子的峰面积(或与内标峰面积比值)为Y对应质量浓度X([color=black]m[/color]g/L)做标准曲线,得到的线性方程和相关系数见表2;以10倍信噪比(S/N)计算得到生物素的定量下限,结果见表2。表2 生物素标准溶液的线性方程、相关系数和定量下限(LOQ)[/size][table][tr][td][align=center][size=16px]分析物[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]线性范围/(ng/mL)[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]线性方程[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]R[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]LOQ/(ug/100g)[/size][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]生物素[sub] [/sub][/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]0.2~50[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]Y=3078.1X-106.32[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]0.9993[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]0.5[/size][/align][/td][/tr][/table][size=16px][color=black]2.3回收率和精密度[/color][color=black]生物素在奶粉中天然存在[/color],选取已知生物素含量的奶粉作为基质进行加标。具体添加水平为:[color=black]0.5,5,50[/color] ug/100g。[color=black]每个[/color]水平重复6次,[color=black]同时做该奶粉的本底实验。[/color]按照1.4前处理方法处理后上机检测,回收率计算结果(扣除空白后)见表3。结果表明,该方法生物素的平均回收率为87.2%~110%,相对标准偏差(RSD,n=6)为2.3%~5.2%,均满足实验要求。[/size][align=center][size=16px]表3 奶粉生物素的加标回收率和相对标准偏差(n=6)[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=16px]分析物[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]添加水平(ug/100g)[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]回收率/%[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]相对标准偏差/%[/size][/align][/td][/tr][tr][td][align=center][size=16px]生物素[/size][/align][size=16px][sub] [/sub][/size][/td][td][align=center][size=16px]0.5[/size][/align][align=center][size=16px]5[/size][/align][align=center][size=16px]50[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]86.8[/size][/align][align=center][size=16px]93.2[/size][/align][align=center][size=16px]91.6[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][align=center][size=16px]4.6[/size][/align][align=center][size=16px]3.3[/size][/align][align=center][size=16px]2.1[/size][/align][size=16px][/size][/td][/tr][/table][size=16px][color=black]2.4实际样品分析[/color][color=black]为进一步验证该方法的准确性,采用本方法和《[/color]GB 5009.259-2016[color=black]》微生物法同时对北京普天同创生物科技有限公司的奶粉质控样品BQC1051147452生物素含量进行检测,结果见表4[/color]。由表4可知,UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法测定结果与国标方法的结果基本一致,无显著性差异,但前者所需时间更短,精密度更好。[/size][align=center][size=16px]表4 奶粉质控样品[color=black]BQC1051147452[/color]生物素的测定结果[/size][/align][table][tr][td][align=center][size=16px]检测方法[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]特性值区间(ug/100g)[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]测定平均值(n=6)[/size][/align][/td][td][align=center][size=16px]相对标准偏差/%(n=6)[/size][/align][/td][/tr][tr][td][size=16px]UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS法微生物法[sub] [/sub][/size][/td][td][align=center][size=16px]15.6~22.4[/size][/align][align=center][size=16px]15.6~22.4[/size][/align][size=16px][/size][/td][td][size=16px]18.718.1[/size][/td][td][align=center][size=16px]2.5[/size][/align][size=16px] 4.6[/size][/td][/tr][/table][size=16px]3 结语本文建立了超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法(UP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS)测定奶粉中[color=black]生物素[/color]含量的分析方法。该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度,前处理步骤简单,分析速度快,特别适合大批量样品的检测。参考文献:[1] GB 5009.259-2016 食品安全国家标准 食品中生物素的测定.[2] 薛霞, 赵慧男, 魏莉莉, 等. 超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定蜂蜜中五种水溶性维生素的含量[J]. 食品与发酵工业. 2021,47(12) : 250-256.[3] 李佳兴, 周利, 金艳, 等. 超高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]-串联质谱法测定枸杞子中8种水溶性维生素[J]. 食品科技. 2018,43(11) : 336-341.[/size]