莫扎伐普坦碱片段

从人类基因组草图到完全图谱——论基因组重复片段研究作者：李东卫，张玉波（中国农业科学院农业基因组研究所，“岭南现代农业”广东省实验室，深圳 518120）2001年发表的人类基因组草图并没有包含全部的基因组序列，直到二十年后，科学家们才正式宣布完成了人类全序列基因组图谱，这其中主要的技术障碍就是重复片段的测序工作。重复片段（segmental duplications，SDs）是指广泛存在于基因组中的大于1 kb且序列相似性超过90%以上的大片段。它们可以通过基因组重排及拷贝数变异产生新基因和驱动进化，其大量存在于子端粒中，并与哺乳动物细胞复制性衰老以及癌症等重要生物学过程密切相关，一直以来备受科学家关注。但是其序列特点使得常规的测序技术难以完全准确测出全部序列，是基因组组装工作的一个难点。人类基因组全图谱的完成将重复片段在生物体进化、延缓衰老、疾病治疗等方面的研究提供基础。本文将就重复片段的重要性，研究的技术难点，研究现状以及未来展望等方面展开论述。重复片段的重要性重复片段是基因组中序列高度相同的大片段，具有广泛的结构多样性。它们占人类参考基因组（T2T-CHM13）中的7.0%，长度为218 Mbp[2 ]，在中心体及子端粒区域富集高达10倍。中心体所包含的5个典型重复为：α卫星，β卫星，CER卫星，γ卫星，CAGGG重复，以及重复子4。子端粒所包含的典型重复为：端粒相关重复（TAR）以及传统的（TTAGGG）n重复[4 ]。重复片段可以介导染色体重排，使常染色体和异染色体之间通过同源重组产生镶嵌类型的重复的染色质[5 ]。在最近新鉴定的人类重复片段中，Mitchell R等预测了182个新的候选蛋白编码基因，并使用T2T-CHM13基因组重构了重复基因（TBC1D3，SRGAP2C，ARHGAP11B），这些基因在人额皮质增生中具有重要作用，揭示了重复片段结构在人和他们近亲物种之间的巨大进化差异[6 ]。大量的染色体子端粒区含有重复片段[8 ]。复制性衰老被认为是一种抗癌机制，限制细胞增殖。长寿的有机体经历更多的细胞分裂，因此具有更高的产生肿瘤的风险。端粒酶能够增加端粒的长度，促进癌细胞不断增殖，因此长寿动物体细胞倾向于抑制端粒酶的活性，从而抑制肿瘤发生的风险[10 ]研究难点：大片段长度、多拷贝数、序列高度相似 重复片段的大的片段长度，多拷贝数以及序列的高度相似是长期以来其研究的难点。各种测序技术的发展致力于解决这个问题。重复片段长度范围是1到400 kb [12 ]。而且，标准的长读段校正工具，例如MUMmer 或Minimap2不能够有效的捕捉低相似的重复片段，也经常将重复片段与其它调控元件混淆[14 ]，为重复片段的研究带来机遇。尤其是PacBio的HiFi读段，具有长读段的同时还具有较高的准确度。但是，很多重复片段的长度要比HiFi读段的平均长度要长，因此很难完全准确的进行组装[3 ]。染色体重排，尤其是染色质断裂常发生在高GC区域[16 ]。同时，在T2T-CHM13基因组基础上，Mitchell R等首次进行了全基因组重复片段的研究。与当前人类参考基因组（GRCh38）鉴定的167 Mbp复制片段相比，鉴定了更多的（218 Mbp）非冗余重复片段（图2 a, b）。新发现91%的重复片段能更好地代表人的拷贝数，通过与非人灵长类基因组相比，前所未有的揭示了人类和其它近亲在重复片段结构中的杂合性以及广泛的进化差异[17 ]。图2 T2T-CHM13中新鉴定的染色体内（a）与染色间（b）的重复片段[1 ]。利用重复片段解析衰老机制未来可期新组装的T2T-CHM13的拷贝数比GRCh38高9倍，因此它能更好的呈现人类拷贝数变异。通过鉴定新基因的拷贝数变异，可筛选相应的药物治疗靶点。例如，CHM13鉴定到LPA、MUC3A、FCGR2基因的拷贝数变异与疾病相关[1]。此外，对于尚具争议的疾病标志基因，例如乳腺癌中ESR1 基因[18]，可以通过CHM13对其进行分子进化分析，进而鉴定其突变和扩增，确定其在乳腺癌中的作用。尽管端粒作为抗衰老靶标已研究多年，但是端粒长短变化与复制性衰老的关系仍不清楚。细胞减数分裂过程中端粒变短的机制是什么？重复片段拷贝数变异与端粒变短有无相关性？很多研究已证明端粒酶具有延长端粒长度的作用，具体的机制是什么？这些问题因此前端粒不能被准确测序而长期未解决。现在，人类基因组完全图谱已基本实现，相信这些谜团会很快解开。未来可以根据人类年龄增长过程中端粒重复片段的拷贝数变异，解析其抗衰老的机制。通过人为干预其拷贝数，可能用于探索生命的极限。1. Vollger MR, Guitart X, Dishuck PC, Mercuri L, Harvey WT, Gershman A, Diekhans M, Sulovari A, Munson KM, Lewis AM et al.Segmental duplications and their variation in a complete human genome. bioRxiv.2021:2021.2005.2026.445678.2. Prodanov T, Bansal V.Sensitive alignment using paralogous sequence variants improves long-read mapping and variant calling in segmental duplications. Nucleic Acids Research.2020 48(19).3. Bailey JA, Yavor AM, Massa HF, Trask BJ, Eichler EE.Segmental duplications: Organization and impact within the current Human Genome Project assembly. Genome research.2001 11(6):1005-1017.4. Courseaux A, Richard F, Grosgeorge J, Ortola C, Viale A, Turc-Carel C, Dutrillaux B, Gaudray P, Nahon JL.Segmental duplications in euchromatic regions of human chromosome 5: a source of evolutionary instability and transcriptional innovation. Genome research.2003 13(3):369-381.5. 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01研究背景Eurofins Discovery是全球领先的早期药物研发服务平台，拥有超过40年的药物发现研究经验。作为业内领导者，Eurofins Discovery为研究者提供包括但不限于药物化学、合成化学、体外药理学、安全性药理学与功效、ADME-Tox（药物吸收、分布、代谢、排泄和毒性研究）以及定制蛋白质和检测服务。Eurofins Discovery支持多种药物发现，如GPCRs（G蛋白偶联受体）、激酶、离子通道、核激素受体以及其他蛋白质和酶。在药物研发领域，GPCR家族因其在细胞信号传导中的重要作用而备受关注。近日，Eurofins Discovery团队利用前沿的生物物理技术--光谱位移（Spectral Shift, SpS），在属于GPCR家族的人类腺苷A2A受体（A2AR）上发现了新拮抗剂片段，为GPCR药物设计提供了新视角。与此同时，该研究也利用了来自NanoTemper公司专利的MST（微量热泳动）、TRIC（温度依赖的荧光强度变化）和nanoDSF技术设计GPCR配体。这项研究不仅为GPCR药物开发提供了新策略，也为基于片段药物发现设计（FBDD）带来了新「组合拳」！02技术亮点基于Eurofins Discovery片段文库和Eurofins CALIXAR专利的去垢剂，利用MST-TRIC和超灵敏光谱位移技术，可以在单剂量实验中，从2342个片段库快速筛选出826个片段，作为第一轮初步Hits筛选。之后，利用MST-TRIC和光谱位移技术进行第二轮Hits确认。利用Echo® MS声滴喷射技术，实现了在384孔板中的纳升级精确分配，确保了数据的稳健性。利用nanoDSF技术作为正交检测手段，进一步确认这些片段Hits的稳定性。最后进行A2AR与参考化合物和片段苗头化合物的分子对接研究（Docking Studies）。点击此处，解锁海报全文 Eurofins Discovery | 片段药物发现新「组合拳」 原创_诺坦普科技（北京）有限公司 (instrument.com.cn)03关于NanoTemperNanoTemper的愿景是致力于创造一个任何疾病都可以被治愈的世界！NanoTemper是全球领先的科学仪器制造商，2008年成立于德国慕尼黑，历经十余载发展，在全球13个国家设立分支机构。卓越的产品和优质的服务使NanoTemper成为全球成千上万的制药公司、学术研究机构及科技公司的首选合作伙伴。Dianthus 高通量筛选平台 可直接在溶液中检测亲和力，无需固定 检测一个Kd仅需1min 标准规格384孔板，单次运行可检测32个Kd 无微流控系统，无需清洗维护 专利技术加持：TRIC（温度依赖的荧光强度变化），Spectral Shift（光谱位移）PR Panta 蛋白稳定性分析仪 高数据质量，超高分辨率，多参数精准表征 天然条件下检测，无需染料标记 检测浓度范围广，低样品消耗量 可同时支持四大技术模块：nanoDSF，DLS，SLS，背反射

p style=" text-align: justify " 　　你是否也遇到过类似的问题: /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 今天怎么这么背，每件事情都失算， br/ /p p style=" text-align: justify " 　　只想用机械打断法做个核酸样本片段化， /p p style=" text-align: justify " 　　却在转移时把样本混淆了， /p p style=" text-align: justify " 　　时间有限，样品不少，实验无法按预计完成…… /p p style=" text-align: justify " 　　谁能告诉我该怎么办? /p p style=" text-align: justify " 　　放弃曾经(或目前仍为)最主流的二代测序核酸样本片段化方法机械打断法,尝试更便捷、经济、高效的片段化方法新宠酶切法。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/26c8626e-26dc-4cc5-833a-02773eaef459.jpg" title=" 01.jpg" alt=" 01.jpg" width=" 392" height=" 259" style=" width: 392px height: 259px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 酶切片段化法相较机械打断法有何过人之处? /strong /p p style=" text-align: justify " 　　一步完成，无需样本转移，不会混淆样本 /p p style=" text-align: justify " 　　速度更快，需要手动操作的时间更少 /p p style=" text-align: justify " 　　样品损失少，产率高，文库质量更好、复杂度更高 /p p style=" text-align: justify " 　　硬件投入低甚至无需硬件投入 /p p style=" text-align: justify " 　　而相较于市面上其它品牌的酶切打断试剂盒，安捷伦最新推出的 SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒则拥有更多亮点。 /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 亮点 1：在文库质量方面具有更高的覆盖率和复杂性 /strong /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒在新鲜冷冻和 FFPE 样品中表现出相同或更高的覆盖率(图 1)及更高的复杂性(图 2)。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/110508c1-d041-46cc-ac50-069662d70890.jpg" title=" 02.jpg" alt=" 02.jpg" width=" 501" height=" 319" style=" width: 501px height: 319px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-size: 14px " 图 1. 与机械剪切工作流程相比，SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒可提供更好的 100x 碱基覆盖率。利用试剂盒或 Covaris 仪器对从新鲜冷冻和 FFPE 样品中提取的 10 ng DNA 进行剪切打断。FF 和 FFPE 1(DIN =2.7，ddCq = 1)为子宫样品。FFPE 2 为喉肿瘤样品(DIN = 2.3，ddCq = 2)。 /span /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/7778f9e4-5626-4585-af12-1d3ad8e516c8.jpg" title=" 03.jpg" alt=" 03.jpg" width=" 519" height=" 303" style=" width: 519px height: 303px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-size: 14px " 图 2.与机械剪切工作流程相比，SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒可得到更高的文库复杂性( HS文库大小)。利用 SureSelect XT HS 和XT 低起始量酶切片段化试剂盒或 Covaris 仪器对从新鲜冷冻和 FFPE 样品中提取的 10ng DNA 进行剪切打断。FF 和 FFPE 1(DIN= 2.7，ddCq = 1)为子宫样品。FFPE2 为喉肿瘤样品( DIN = 2.3，ddCq = 2 )。 /span /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 亮点 2 ：简单化一的程序应对广泛样本类型与样本质量 /strong /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒一个程序应对各种 CG 含量样本、不同类型样本(血液、新鲜冷冻组织、FFPE样本等)，以及不同质量的样本。无需针对不同样本类型或样本质量修改或重新摸索最优程序。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/1a8fffd2-b9f6-454b-bba8-6fc2f505eac9.jpg" title=" 04.jpg" alt=" 04.jpg" width=" 459" height=" 300" style=" width: 459px height: 300px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-size: 14px " 图 3. SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒对质量不同的 DNA 样品可产生相似的 DNA片段化模式。 /span /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 亮点 3：同一程序应对不同起始量样本，无需调校程序 /strong /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒一个程序应对从10ng – 200ng大跨度起始量的 DNA 样本。无需根据不同的起始 DNA 量优化和调整实验程序。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/3fb00c0a-8957-445a-933f-a46913a69307.jpg" title=" 05.jpg" alt=" 05.jpg" width=" 462" height=" 273" style=" width: 462px height: 273px " / /p p style=" text-align: justify " 　　 span style=" font-size: 14px " 图 4. SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒针对各种 DNA 起始量，可产生高度一致的 DNA 片段谱。 /span /p p style=" text-align: justify " 　　 strong 亮点 4：对 EDTA 的超强容忍度，无需额外纯化步骤 /strong /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒对不同的 DNA 缓冲液条件不敏感，从而省略了其它酶剪切方法所需的纯化或中和步骤。分别保存在 Tris、0.1× TE(10 mmol/LTris、0.1 mmol/L EDTA，pH 7.5)和 1× TE(10 mmol/LTris、1 mmol/L EDTA，pH 7.5)中的 DNA 可以产生高度相似的 DNA 片段谱(图 5)。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/5ba1fb35-b470-4f7d-83fd-5786367d0796.jpg" title=" 06.jpg" alt=" 06.jpg" width=" 275" height=" 450" style=" width: 275px height: 450px " / /p p style=" text-align: justify " 　 span style=" font-size: 14px " 　图 5. SureSelectXT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒可用于不同的 DNA 缓冲液，并显示了高度相似的 DNA 片段谱。将从新鲜冷冻组织中提取的 10ng DNA 作为起始样品，分别保存在 Tris、0.1× TE(和 1× TE中。将 DNA 样品进行剪切并用以下方法进行文库制备：A. SureSelectXT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒和 SureSelect XT HS 试剂盒。B. Kapa HyperPlus 试剂盒。B 图显示，保存在 1× TE 中且在没有活化溶液的情况下酶解的 DNA，观察到片段化受到完全抑制(橙色线)。 /span /p p style=" text-align: justify " 　　SureSelect XT HS 和 XT 低起始量酶切片段化试剂盒的其它亮点还包括从低质量的 FFPE 样本中获得的假阳性数据的量更少，以及更少的 C 到 T 的突变。该试剂盒支持 SureSelect XT HS 和 SureSelect XT 低起始量建库试剂，实现快速的无需机械打断的文库构建。 /p