氨基乙基氨基丙基倍半硅氧烷水溶液

Venusil HILIC亲水作用色谱柱 　　亲水作用色谱(Hydrophilic Interaction Chromatography，HILIC)是近年来色谱领域研究的热点，博纳艾杰尔科技推出丙基酰胺键合硅胶为基质的HILIC色谱柱, 对极性化合物，如极性代谢物，碳水化合物或肽具有极佳的分离效果。 　　丙基酰胺键合硅胶克服了传统正相色谱柱在水相条件下不稳定的缺点,其常使用流动相是和反相色谱相同的水相缓冲液( 40%)及有机溶剂,但是其梯度条件通常是初始为高比例有机相，逐步加大水相含量 极性丙基酰胺键合硅胶的HILIC色谱柱在反相条件下，可以有效的保留极性化合物，是一种崭新的极性化合物HPLC分离解决方式. 　　 　　图1. Venusil HILIC 比传统正相色谱柱更稳定 　　样 品：VB1, VB6, VC, VB2 　　老化条件：甲醇:20 mM NaH2PO4 (pH=7.0) = 40 : 60 1.0mL/min 温度：40℃ 　　分析条件：0.1%TFA:ACN = 90:10 流速: 1.0mL/min 温度：30℃ ，UV280nm 　　 　　色谱柱: Atlantis C18 4.6×250mm，5μm 　　流动相：98%的0.005M的磷酸 钠 (pH=7)：2% 甲醇 　　流 速： 1ml/min 　　柱 温： 25℃ 　　检 测： UV 210nm 　　 　　色谱柱：Venusil HILIC 4.6×250mm，5μm 　　流动相: A: 0.1%TFA水溶液， 　　B: 乙腈， 　　A:B=75:25 　　流 速: 1 mL/min 　　温 度: 25℃ 　　检 测: UV 210 nm 　　图2. Venusil HILIC与C18分离井冈霉素对比色谱图 　　图2. 结果显示，反相C18在98%的水相条件下，几乎没有保留的强极性化合物井冈霉素，在25%的乙腈条件下，使用丙基酰胺键合硅胶的Venusil HILIC得到了很好的分离。所以，Venusil HILIC色谱柱是强极性化合物分离的有力工具。 　　丙基酰胺键合硅胶的HILIC色谱柱用于低聚糖的分析，显示出比氨基柱更好的稳定性，更好的分离效果，尤其在使用ELSD检测器的时候，丙基酰胺键合硅胶比氨基键合硅胶具有更低的背景噪音，图3。 　　 　　图3. 丙基酰胺键合硅胶HILIC色谱柱与氨基键合硅胶柱分离葡萄糖对比 　　样品：葡萄糖标准品(购至Sigma) 　　检测：ELSD 　　色谱柱：4.6×250mm，5μm 　　色谱条件：乙腈/水(80:20),1mL/min，30℃ 　　图3显示，丙基酰胺键合硅胶填充的HILIC色谱柱可以将葡萄糖在水溶液中存在的两个端基异构体(即α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖)区分开，而用氨基柱则只能得到一个相对较宽的色谱峰，结果表明了丙基酰胺键合硅胶HILIC柱在分析糖类成分方面的独特优势。 　　腺苷类强极性抗肿瘤药物地西他滨(Decitabine)在普通的反相C18色谱柱上检测有关物质存在杂质分离度不够或检测不出的问题，使用丙基酰胺键合硅胶的Venusil HILIC色谱柱获得了极佳的分离效果，图4。 　　 　　图4. 地西他滨有关物质分析色谱图 　　Venusil HILIC(丙基酰胺键合硅胶)，4.6×150mm，5μm，乙腈：水=96∶4，1ml/min， 　　UV@244nm，室温 Venusil HILIC 丙基酰胺键合硅胶.pdf

Ying Qing Yu与Martin Gilar 美国马萨诸塞州米尔福德沃特世公司 简介 本应用纪要中，我们介绍了沃特世专利RapiGest&trade SF试剂的物理化学性质及其应用领域。2002年，我们首次推出RapiGest SF，这一创新产品是帮助酶消解的有利工具，可促进溶液中蛋白的消解，它能够改善样品制备过程中蛋白的溶解度。 RapiGest SF提高酶解速率与完全程度的机理详见图1。温和的蛋白变性可打开蛋白结构并暴露酶切位点，以供酶切。在RapiGest SF溶液中，酶对变性的耐受性优于普通蛋白，并能保持活性。在加入酶之前高温加热RapiGest SF溶液可使球蛋白更为完全变性，之后需将酶与样品一起进行37 ° C的孵育。 图1 蛋白底物在RapiGest SF溶液中变性􀉼 之后对蛋白酶切更为敏感 超过200多家行业内杂志引用了使用RapiGest SF进行样品溶解的案例，大部分为蛋白组学的应用。最近，许多制药实验室使用RapiGest SF用于蛋白药物的确证。因为酶消化的速度的提高并在LC、MS分析前极易清除，RapiGest SF已被多个应用领域广泛接受，其中包括高级序列研究的LC/UV/MS蛋白药物的肽图分析。 讨论 什么是RapiGest SF? RapiGest SF是酸性不稳定表面活性剂，在酸性条件下极易水解。1这种独特的性质，在需要的时候，可用于从溶液中清除表面活性剂。RapiGest SF的结构及其水解副产物见图2。酸性不稳定的性质可在pH2条件下，45分钟内达到完全降解。 该表面活性剂可降解为两个产物：dodeca-2-one和3-（2,3-二羟基丙基）丙磺酸钠。前者与水不能互溶，可通过离心清除。后者在水溶液中溶解度很高，而在反相LC模式下不保留。酶消解后的水溶液可直接进行HPLC、LC/MS或MALDI-TOF MS进行分析。 消解后的清除 样品分析前无需额外去清除表面活性剂（如透析）。在分析前，酶消解后通常经过酸（如甲酸、三氟乙酸（TFA）或盐酸（HCl））的酸化，降解RapiGest SF。建议降解条件pH &le 2。 胰蛋白酶消解的兼容性 胰蛋白酶是最常见的蛋白水解酶，可用于肽图分析和蛋白组学的应用。我们研究了在添加RapiGest SF的情况下胰蛋白酶的活性作用，并与文献中最常见的变性剂的作用做了对比。本检测基于胰蛋白酶诱导N-&alpha -苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）在50 mM重碳酸胺（pH 7.9）中的室温水解。胰蛋白酶活性的变化通过UV 253 nm下测量BAEE水解率进行计算。在选择的变性溶液中，胰蛋白酶活性与对照样品进行对比（非变性剂）。结果见于表1。 表1中的数据说明低浓度下（0.1%） RapiGest SF不抑制胰蛋白酶的活性。这与结构上类似的表面活性剂SDS不同，SDS是很强的变性剂，可会使胰蛋白酶失活。尿素、乙腈或盐酸胍也是胰蛋白酶消化的变性剂。但是乙腈是强洗脱剂会干扰消解样品进行反相LC分析。正如我们所知，尿素可使蛋白共价修饰，盐酸胍也和SDS一样可以使酶失活。 本实验说明蛋白酶的活性受到蛋白溶液中所用变性剂的影响。RapiGest SF在从低到高的浓度下均不改变酶活性，因此，最佳的蛋白消解条件是无需过量酶即可达到酶解的结果。 快速蛋白消解 对蛋白酶解存在抗性的蛋白使用RapiGest SF试剂，可在数分钟内消解完全。完全消解球蛋白、马肌红蛋白只需要5分钟内即可完成。该试剂辅助的消解结果与对照见图3。由于肌红蛋白是球蛋白，众所周知，若没有表面活性剂将难以消解。在对照反应中，与胰蛋白酶孵育9小时后只有少量的蛋白可以消化。使用了RapiGest SF试剂，总体的消解的效率显著提升。 在蛋白药物肽图中的序列覆盖范围更大 RapiGest SF在蛋白组学的样品前处理中广泛使用，是有效的蛋白溶解变性剂。最近越来越多的生物制药实验室在肽图分析中采用了RapiGest SF。一些发表的论文记录了使用RapiGest SF进行蛋白药物消解的优势。4,5经报导的RapiGest SF浓度范围为0.05 -1%，取决于蛋白疏水性与浓度。 我们发现浓度范围为0.05 -1%的RapiGest SF足以使各种大小的蛋白变性，高浓度RapiGest SF适合全细胞蛋白提取的实验。 单抗（mAbs）肽图分析一直以来都因为难以消解这些大疏水蛋白而难以实现。肽图分析的目的是确认蛋白序列并发现所有存在后翻译修饰（PTMs）的蛋白。图4举例说明了RapiGest SF辅助的人单抗消解的实例。样品制备与分析的参数以UPLC® 和四级杆Tof质谱分析的参数已列表作为指导。 图4显示实验中总序列覆盖率为98%。数据分析通过BiopharmaLynx&trade v.1.2软件得到。高序列覆盖率（98%）说明单抗完全消解。LC/MS分析中没有发现错误酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。剩下的2%未确认的序列为少数二个氨基酸的肽或单个氨基酸（R或K），而无法在反相柱上保留。 样品制备 人单抗样品（10 &mu L, 21 mg/mL）在含有0.1% （w/v） RapiGest SF 的50 &mu L 50 mM重碳酸铵中溶解。将2 &mu L 0.1 M的二流苏糖醇（DTT）加入样品，样品在50 ° C加热30分钟，加入4 &mu L 0.1 M的碘代乙酰胺，在样品冷却至室温后样品在黑暗中静至40分钟。 样品中加入8 &mu g胰蛋白酶（胰蛋白酶浓度= 1 &mu g/&mu L），样品在37 ° C孵育过夜。消解样品与1%甲酸与10%乙腈混合（1：1，v：v）。用Milli-Q水（Millipore）稀释至5 pmol/&mu L后进行LC/MS分析。 LC 条件 LC 系统 沃特世 ACQUITY UPLC® 系统 色谱柱 ACQUITY UPLC BEH 300 C18 肽分离专用柱, 2.1 x 100mm （P/N = 186003686） 柱温 40 ° C样品进样 2 &mu L （10 pmol） 溶液A 0.1% 甲酸水溶液 溶液B 0.1% 甲酸乙腈溶液 流速 200 &mu L/min 梯度 0-2分钟:2%B 2 &ndash 92分钟：2 -35% B 92 -102分钟：35 - 50% B 102.1 -105 分钟：90% B 105.1-110分钟：2% B MS条件 MS系统 沃特世SYNAPT&trade MS （V型） 毛细管电压 3.2 kV 源温度 120 ° C 去溶剂温度 350 ° C 去溶剂气 700 L/hr MS 扫描速率 1 秒/次 锁定质量通道 100 fmol/&mu L Glu-Fib多肽（m/z 785.8426, z = 2），流速20 &mu L/min 与其他的蛋白酶合用 我们测试了RapiGest SF与多种蛋白酶的适配性，如Asp-N, Lys-C与Glu-C。在酶解前使用RapiGest SF变性蛋白获得了有效的消解结果。 蛋白去糖基化的用途 RapiGest SF也用于测试其它酶，如PNGase F，该酶用于酶切糖蛋白N-连接的糖基。2图6说明了去糖基化鸡蛋卵清蛋白。在RapiGest SF介质中PNGase F消解2小时后观察到了完全的去糖基化反应。 结论  RapiGest SF促进了蛋白酶解的速度与完全程度，能够得到蛋白药物序列覆盖率很高的肽图分析。  RapiGest SF是适用于蛋白组学、糖蛋白与生物制药应用的领域  几乎无需消解后样品处理，简单样品酸化，足以从溶液中去除RapiGest SF。多种情况下LC/MS分析前只需简单稀释。  RapiGest SF简化了样品制备方法，可提高分析通量；使用该方法提高实验室工作效率并提高数据质量。 参考文献 1. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly, mass spectrom- etry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal. Chem. 2003 75: 6023-6028. 2. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC, A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun.Mass Spectrom. 2004 18: 711-715. 3. Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometry characterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005 19: 2331-2336. 4. Bailey MJ, Hooker AD, Adams CS, Zhang S, James DC. A platform for high- throughtput molecular characterization of recombinant monoclonal antibodies, J. Chrom. B. 2005 826: 177-187. 5. Huang HZ, NicholsA, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by RapiGest SF assisted digestion. Anal. Chem. 2009 81 (4): 1686-1692.

p 　　中国科学院院士、中国科学技术大学教授杜江峰领衔的研究团队运用量子技术首次在室温水溶液环境中探测到单个DNA分子的磁共振谱，从而向运用单分子磁共振研究生物分子在生理环境中的构像和分子间相互作用迈出了重要一步。该工作发表在2018年9月出版的《自然-方法》上[Nature Methods 15, 697–699 (2018)]，并被选为五篇封面标题文章之一。 /p p style=" text-align: center " img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/617791fb-2bec-4aac-912d-c2facfea4a51.jpg" title=" 1.jpg" alt=" 1.jpg" / br/ span style=" font-size: 14px " strong 基于钻石传感器实现水溶液中的DNA分子探测 /strong /span /p p 　　磁共振技术能够在溶液环境准确无损地获取物质的组成和结构信息，是目前研究生物分子结构和动力学的最有效的工具之一。然而，传统的磁共振技术受限于探测灵敏度，其研究对象通常为数十亿分子的宏观体系，无法实现单分子的研究。杜江峰团队利用钻石中的氮-空位点缺陷作为量子传感器(以下简称“钻石传感器”)，它在绿色激光和特定频率微波脉冲的调制下，形成对磁信号敏感的量子干涉仪，将微弱的磁信号放大为量子相位信号，并利用光学手段进行读出。同时，由于钻石传感器的尺寸在原子量级，可以实现纳米尺度的空间分辨能力。因此，钻石传感器可以实现单个分子探测，并能通过磁共振谱学解析其结构和动力学等信息。 /p p 　　杜江峰团队此前的研究已经表明，基于钻石传感器能够探测单个蛋白质分子的磁共振谱[Science 347, 1135–1138 (2015)]，实现了单分子磁共振的首次突破。该实验中的蛋白质分子被生物胶固定在钻石表面。然而，水溶液环境是生物分子保持生物活性并进行生命活动所必须的环境，在水溶液环境中进行单分子的磁共振探测是研究其生物功能的必经之路。杜江峰团队与南加州大学教授覃智峰合作，以双链DNA分子作为探测对象，此DNA分子被放置在钻石表面并填充水溶液以保持其生理状态。首先，为了防止DNA分子在溶液中的扩散，该团队设计了一套化学反应流程，将DNA分子的一条链(下图红色虚线示意)一端通过氨基修饰，化学键合“拴”在钻石表面，这也保证了DNA分子在钻石表面的均匀分布 同时将一种常用的氮氧自由基顺磁标签标记到DNA的另一条链(下图蓝色实线示意)，其可以在水溶液中与键合链自由地复合-解链。其次，得益于钻石微纳技术的发展，加工得到钻石纳米柱，同时改进微波操控技术，使得探测效率大幅提升，能够快速测得单分子磁共振谱，信号获取时间从小时量级缩短到数分钟。最终，该团队成功地获取了水溶液环境下单个DNA分子的磁共振谱，并通过谱分析得到其动力学和环境特征信息。通过谱线展宽和仿真计算得到该DNA分子自由基的运动特征时间信息 通过谱线超精细分裂大小得到该DNA分子所处的疏水性环境信息。 /p p 　　该工作为在水溶液环境中研究单个生物分子的结构和功能提供一种新的技术方法，是朝向细胞原位单分子研究迈出的重要一步。以此为基础，和扫描探针、梯度磁场等技术相结合，未来可将该技术应用于生命科学领域的单分子成像、结构解析和动力学检测，从单分子层面理解生物特性和生命功能，具有广泛的应用前景。审稿人评述该工作：“单分子技术是当代生命科学的发展至关重要的一项技术，实现单个DNA分子的探测及其动力学行为研究将引起相关领域科学家很大的兴趣”。 /p p 　　中科院微观磁共振重点实验室石发展、孔飞和赵鹏举为该论文并列第一作者，杜江峰和覃智峰为该文通讯作者。此项研究得到科技部、国家自然科学基金委、中科院和安徽省的资助。 /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/8766fc73-bfa5-40f0-a81f-a13f1f55aed4.jpg" title=" 3.jpg" alt=" 3.jpg" width=" 551" height=" 621" style=" width: 551px height: 621px " / /p p style=" text-align: justify " span style=" font-size: 14px " strong 实验方案示意图。基底为钻石单晶，为提升光学性质，微纳加工得到圆柱形阵列，钻石传感器位于表面下方数纳米，DNA分子“拴”在圆柱端面上，并置于水溶液中。 /strong /span /p p style=" text-align: center" img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201809/uepic/349bdc77-0cbe-4552-8f10-12277b1fb637.jpg" title=" 2.jpg" alt=" 2.jpg" width=" 551" height=" 555" style=" width: 551px height: 555px " / /p p style=" text-align: center " br/ span style=" font-size: 14px " strong 实验测得的单个DNA分子的磁共振谱，三条峰为氮氧自由基和氮核自旋的超精细耦合所致。 /strong /span br/ /p