QIAcuity数字PCR系统助力 “细菌耐药性研究及新药开发”
背景近年来,多重耐药性 (multi-drug resistance, MDR) 的出现已成为多国关注的公共卫生问题,作为细菌变异及过度使用抗菌药物的结果,它的主要机制是外排膜泵基因突变,其次是外膜渗透性的改变和产生超广谱酶。最常见的耐药菌为革兰阳性菌MDR-TB和MDR-MRSA,以及在ICU中常出现的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。统计数据显示,血液感染细菌铜绿假单胞菌与30%至50%的高死亡率有关。正因为如此,迫切需要开发新的抗菌药来对抗感染。数字PCR 技术作为一项高灵敏性、高精确性、绝对定量技术,可有效助力病原微生物耐药性分析及新药研发等应用。QIAGEN的QIAcuity数字PCR系统基于纳米微孔板技术,采用集成式一体化设计理念,支持多通道检测,可实现高通量、高灵敏性检测。接下来小编带您一起解读QIAcuity数字PCR系统在该研究领域的实际应用案例。本案例中,来自英国朴茨茅斯大学、泰国纳瑞宣大学和披博宋甘皇家大学的研究人员基于QIAGEN QIAcuity dPCR平台,建立了多重反转录数字PCR (mRT-dPCR),深入研究了氢奎宁(抗疟疾药物)的天然化合物对临床常见微生物的抗感染机制。方法与结果研究者首先在前期细菌实验中发现氢奎宁可以抑制和杀死几种临床重要细菌,即金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌以及常见的多重耐药病原体铜绿假单胞菌。通过进一步研究,作者发现氢奎宁对铜绿假单胞菌的杀菌浓度是其他菌株的2-4倍,且在4-8h内对铜绿假单胞菌不仅有抑菌杀菌作用,还存在呈剂量依赖性。为了进一步验证氢奎宁对多重耐药病原体铜绿假单胞菌的抗菌和耐药机理,即氢奎宁是否能够在铜绿假单胞菌中诱导其主要的外排泵类型,即耐药节结化细胞分化家族 (RND) 相关基因的异常表达。作者利用QIAcuity dPCR系统,建立了多重数字PCR (mdPCR) 和多重反转录数字PCR (mRT-dPCR) 两套研究路线,成功用于快速检测多种临床相关细菌中是否存在mexB、mexD和mexY这三种关键基因,并对其表达量的变化也进行了进一步的分析。结果表明,在0.5X MIC氢奎宁作用1h后,mexD和mexY的表达量分别提高了20.8±4.31和11.8±5.01倍,而相比之下mexB的表达水平则相对稳定(1.6±0.15倍)。这些数据表明,在P. aeruginosa ATCC27853菌株中,虽然氢奎宁诱导了MexCD-OprJ和MexXY外排膜泵的上调,但MexAB-OprM外排膜泵则并没有上调,意味着铜绿假单胞菌是通过上调MexCD-OprJ和MexXY外排膜泵的水平而诱导了一种保护机制来避免氢奎宁引起的细胞应激,进而产生一定程度的耐药性。结论研究者基于QIAcuity dPCR系统建立的多重反转录数字PCR (mRT-dPCR) 技术路线,阐明了低剂量的氢奎宁可诱导铜绿假单胞菌特异性RND型外排膜泵基因表达水平变化,进而引起了一定程度的耐药性。研究者也表示将进一步研究氢奎宁的抗菌活性和副作用,揭示氢奎宁的分子靶标,从而对氢奎宁在临床中的使用提供更多指导。 参考文献:Hydroquinine Possesses Antibacterial Activity, and at Half the MIC, Induces the Overexpression of RND-Type Efflux Pumps Using Multiplex Digital PCR in Pseudomonas aeruginosa. Nontaporn Rattanachak, Sattaporn Weawsiangsang, Touchkanin Jongjitvimol, Robert A Baldock and Jirapas Jongjitwimol 1,4,5,END