黒曲霉

黑曲霉刚从药检所买来，二代冷冻管，用SDA传代后，只有白色菌丝，就是不黑，SDA的ph值是5.46，灭菌温度121℃（实际腔内温度有122℃），20分钟，每次都是把SDA水浴锅煮沸几分钟，分装在灭菌，从12.10传代到现在都不黑，用了商业PDA斜面管，黑了，只是没有白色菌丝，直接就是黑色孢子，不知道哪个环节出问题了，望老师不吝赐教

食品中黄曲霉毒素的测定，主要有TLC、ELISA、HPLC 等方法，TLC法灵敏度和重现性较差；ELISA法重现性差，易受样品基质干扰假阳性率高，仅能作为筛选方法。近年来，由于HPLC法具有灵敏度和准确度高、方法重现性好等优点，现已成为黄曲霉毒素分析的主要手段。HPLC法测定黄曲霉毒素，一般使用灵敏度和选择性较好的荧光检测器。但由于黄曲霉毒素的荧光强度会受溶剂影响，正相色谱中，B1和B2的荧光强度仅稍低一点，不需衍生化；而在常用的反相色谱中，B1和G1两种异构体荧光强度很弱，需进行衍生化，提高其荧光强度，灵敏度才能满足一般食品法规的限量。衍生化的方法一般有柱前和柱后两类， 柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、过溴化吡啶溴以及电化学和光化学等方法。近年来，很多标准方法利用免疫亲合柱净化，HPLC柱后衍生对花生和玉米等农产品和食品中黄曲霉的含量进行了分析，方法检出限能够达到1 μg/kg以下。Q1。免疫亲和柱的填料是什么，它是怎样工作的，为什么要用它？ 免疫亲合柱对于欧们学化学的好像陌生了一点，不过你把它当成一种层析柱就行了。它的所谓填料就是固定了抗体的凝胶（黄曲霉毒素的柱子一般是单克隆抗体），基于抗原抗体反应进行工作，专一性很强，再加上另一种原理（反相或正相液相色谱）的分离，即使你把它当作确证方法也能说的过去。其实免疫亲和柱净化后的样品已经非常干净，直接加溴水也可在荧光分光光度计上进行测定，也是AOAC 991。31正式方法。现在还有一种普通霉菌毒素净化柱（不是免疫柱）要便宜一些，能做的霉菌毒素品种也多，但是专一性就差些。Q2。Kobra cell可以在线产生溴，这对分析有什么作用？是可以提高灵敏度吗？如果是，溴是如何与黄曲霉素反应的？络合？氧化？还是别的什么？ 由欧以上的论述，应该说是提高反相HPLC分析中黄曲霉毒素B1、G1的灵敏度。反应原理欧还真的没研究，可能和柱后衍生类似（氧化？），考虑到进入精益求精的要求还是不乱猜了吧。Q3。看到书上说黄曲霉素的毒性是KCN的10倍，是砒霜的68倍。晕啊。。。操作时有没有特别的个人防护措施？这个阿胖讲得差不多了，方法也就是用次氯酸钠溶液泡器皿，当然最好不要自己称固体标样，那东东有静电，很容易飞出来，买溶液就行了。要补充的1、就是没阿胖讲的那么可怕，对欧盟出口花生及制品的检测实验室都使用免疫亲和柱净化-HPLC—RF法确证，每年可能要做上万个样品。2、HPLC法的干扰比酶免方法不知道要小多少，有的HPLC筛选方法，提取后不净化就直接进样了，也很少有干扰。采用哪种方法主要是和要求有关，如果让洋人拿着鞭子在后面抽着干，肯定是要用HPLC法；如果就骗骗中国的官僚和老百姓，那就像啊胖说的，酶免法又省钱有省事，嘿嘿。。。。3、GB/T 5009的TLC法，净化方法很差，UV灯下看上去是一条亮带，满足国标20PPB的限量都很勉强，这一点你可看看旧贴http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?BoardID=5&replyID=47615&id=18220&skin=0欧论述的也差不多了。1、AOAC方法简述25g均匀样品，加入氯化钠5 g和125 mL甲醇：水（7+3），均质2min，过滤。取15 mL滤液加30 mL水，再次过滤后，取10 mL过免疫亲和柱，2×10 mL水洗柱，最后用1 mL甲醇洗脱黄曲霉毒素，用水定容至2 mL，供HPLC测定。HPLC条件：色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：甲醇-乙腈-水（1+1+3）；流速：1.0 mL/min； 柱后衍生试剂：100 mg碘溶于2 mL甲醇，加水至200 mL。流速0.3 mL/min；衍生化温度：70 ℃；衍生化时间：55 s；激发波长：360 nm；发射波长： 420 nm；进样量：50 μL。3. 方法技术指标：免疫亲和柱净化，HPLC柱后衍生化的方法回收率(1) 2000年AOAC协同试验结果B1: 82- 109 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)B2: 77- 123 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)G1: 58- 93 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)G2: 62- 105 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)(2) 1991年AOAC协同试验结果B1: 77- 90 %(添加水平：5.8- 17.5 ng/g)B2: 55- 70 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)G1: 76- 98 %(添加水平：2.5- 7.5 ng/g)G2: 36- 55 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)碘衍生化方法的反应温度要70 ℃，需要单独的柱温箱，还要一个打衍生剂的泵。故可以采用以下两种方法来代替碘溶液作柱后衍生（1）过溴化吡啶溴（PBPB）衍生色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3）；流速：1.00 mL/min；衍生化溶液：25 mg PBPB (CAS: 39516-58-3)溶于500 mL水，室温下避光可保存5天；衍生化溶液流速：0.30 mL/min；衍生化反应管：55 cm × 0.5 mm id. 衍生化反应温度：室温。（2）电化学反应池衍生色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3），每升加350 μL HNO3 (5 mol/L)，同时溶解120 mg KBr；衍生化反应池：Kobra cell Rhone Diagnostics Technologies Ltd.，衍生化操作电流：100 μA。

[color=#333333]黄曲霉素（[/color][color=#333333]AFT[/color][color=#333333]）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物，它们是一类结构相似的化合物，已知的种类包括[/color][color=#333333]B1[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]B2[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]G1[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]G2[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]G2a[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]M1[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]M2[/color][color=#333333]、[/color][color=#333333]P1[/color][color=#333333]等十几种。由于不同种类的黄曲霉素的形成条件不同，所以来源分布和毒性也不同。其中最受关注的黄曲霉素[/color][color=#333333]M1[/color][color=#333333]是由动物摄入[/color][color=#333333]B1[/color][color=#333333]后在体内经一系列的化学变化而形成的，而[/color][color=#333333]B1[/color][color=#333333]是自然界中最为常见、毒性最强的一种，仅次于[/color][url=http://www.labtool.net/products.php?cid=157][color=#3f88bf]肉毒毒素[/color][/url][color=#333333]。[/color][color=#333333][/color][color=#333333]黄曲霉无处不在，是我国粮食和饲料中常见的真菌，对食品和饲料污染的发生和程度随地理和季节因素以及作物生长、收获、贮存的条件不同而异。当粮食未能及时晒干及储藏不当时往往容易被黄曲霉或寄生曲霉污染而产生此类毒素，而南方及沿海湿热地区更有利于霉菌素的产生。[/color][color=#333333][/color][color=#333333]黄曲霉素主要存在于被[/color][url=http://www.labtool.net/products.php?cid=157][color=#3f88bf]黄曲霉菌[/color][/url][color=#333333]寄生过的的粮食、油及其制品中，如粮食、油料、水果、干果、调味品、乳和乳制品、蔬菜等，在动物性食品如肝、肾脏、咸鱼中以及奶和奶制品中也比较常见。它通常喜欢[/color][color=#333333]“[/color][color=#333333]亲近[/color][color=#333333]”[/color][color=#333333]以下四类食物：[/color][color=#333333]1[/color][color=#333333]、坚果类[/color][color=#333333]花生、核桃、瓜子、开心果、榛子、松仁等。当你发现花生、瓜子、榛子、松仁等果仁轻微变黄甚至发黑、味苦，皱皮变色，看起来有霉变之嫌时，很有可能已被黄曲霉素污染了，一定要丢弃。[/color][color=#333333]2[/color][color=#333333]、谷物类[/color][color=#333333]玉米、大米、大麦、小麦、豆类。凡表面上长有黄绿色霉菌或破损、皱缩、变色、变质的谷物都有可能被黄曲霉素污染，在食用前应仔细挑选，剔除霉变粒。[/color][color=#333333]3[/color][color=#333333]、粮油制品[/color][color=#333333]花生油、玉米油。生产企业如果没有严格挑拣原料，使用霉化的花生、菜籽、玉米等生产食用油，或没有采用精炼工艺或工艺控制不足，都有可能造成黄曲霉素超标。[/color][color=#333333]4[/color][color=#333333]、家庭自制[/color][url=http://www.labtool.net/products.php?cid=157][color=#3f88bf]发酵食品[/color][/url][color=#333333] [/color][color=#333333]腐乳、黄酱。高水分含量和齐全的营养物质很容易使家庭自制的[/color][url=http://www.labtool.net/products.php?cid=157][color=#3f88bf]发酵食品[/color][/url][color=#333333]被黄曲霉污染。[/color][color=#333333]黄曲霉素的耐热性非常好，要在[/color][color=#333333]280[/color][color=#333333]℃[/color][color=#333333]以上才能分解，一般的烹调加工温度都不能将其破坏，而且其在水中的溶解度也较低。有研究证明：在不改变牛奶品质的前提下，先将鲜奶加热至[/color][color=#333333]90[/color][color=#333333]℃[/color][color=#333333]保持[/color][color=#333333]10[/color][color=#333333]分钟，然后冷却至[/color][color=#333333]20[/color][color=#333333]℃[/color][color=#333333]，再经紫外线辐照[/color][color=#333333]30[/color][color=#333333]分钟，才能使其中的黄曲霉素[/color][color=#333333]M1[/color][color=#333333]减少[/color][color=#333333]56.2%[/color][color=#333333]。[/color][color=#333333][/color][color=#333333]在紫外线照射下，毒素可显示荧光，低浓度的纯毒素易被紫外线破。另外，碱性条件下也能破坏一部分黄曲霉素。然而经过碱性、紫外线和高温处理，食物中的营养物质早已丧失殆尽，不适宜食用[/color][color=#333333]预防黄曲霉素的危害要从身边做起、从饮食习惯做起，从生活中的点滴做起，才能使我们更好地远离黄曲霉素。那么，在日常生活中如何应对可能的黄曲霉素的危害呢？[/color][color=#333333]黄曲霉素在日常生活中无处不在，自己在家也要把好食物关，注意一些细节，避免黄曲霉素的危害。[/color][color=#333333][/color][color=#333333]黄曲霉生长产毒的温度范围为[/color][color=#333333]12~42[/color][color=#333333]度，最适产毒温度为[/color][color=#333333]33[/color][color=#333333]度，在潮湿的气候条件下，含水量大于[/color][color=#333333]14%[/color][color=#333333]的花生、大米、玉米、坚果尤其容易滋生黄曲霉菌，一般[/color][color=#333333]3~10[/color][color=#333333]天就可达到致命剂量。当水分含量下降到[/color][color=#333333]14%[/color][color=#333333]以下时，即使污染了黄曲霉也不会产生毒素。[/color][color=#333333][/color][color=#333333]因此，最好的防治方法是预防食物霉变。家中所有食品的储藏都要注意防霉、防氧化，最好在低温、通风、干燥处保存[/color][color=#333333]([/color][color=#333333]温度最好在[/color][color=#333333]20[/color][color=#333333]℃[/color][color=#333333]以下，相对湿度在[/color][color=#333333]80%[/color][color=#333333]以下[/color][color=#333333])[/color][color=#333333]，并避免阳光直接照射。坚果、花生、粮食等尽量购买小包装，打开时认真嗅一下味道，一旦有变味情况立即整袋扔掉，以免抖开后霉菌孢子飞散出来；如果是散装花生、核桃等，最好带壳保存，晒干后，用保鲜盒等密闭储存；购买食物时，如果发现包装不清洁、已破损的不要买。[/color][color=#333333][/color][color=#333333]有霉味的食物一定要坚决丢弃，不能食用；若不小心吃到了霉变食物，要全部吐掉再用清水漱口；哺乳期的母亲尤其要注意饮食，母乳里面的黄曲霉素就是婴儿最早的感染毒素的途径。[/color]