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一、原理 超氧物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)普遍存在于动、植物体内,是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下,核黄素可被光还原,被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2,可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙,后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2,从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后,反应液蓝色愈深,说明酶活性愈低,反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料;水稻或小麦叶片 (二)仪器设备:1.高速台式离心机;2.分光光度计;3.微量进样器;4.荧光灯(反应试管处照度为4000Lx);5.试管或指形管数支。 (三)试剂 1. 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.8);2. 130mmol/L 甲硫氨酸(Met)溶液:称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml;3.750μmol/L 氮蓝四唑溶液:称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml,避光保存;4. 100μmol/L EDTA-Na2溶液:称取0.03721gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml;5. 20μmol/L 核黄素溶液:称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml避光保存。三、实验步骤 1. 酶液提取 取一定部位的植物叶片(视需要定,去叶脉)0.5g于预冷的研钵中,1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆,加缓冲液使终体积为5ml。取1.5~2ml于1000rpm下离心20min,上清液即为SOD粗提液。2. 显色反应 取5ml指形管(要求透明度好)4支,2支为测定管,另2支为对照管,按下列加入各溶液:试剂(酶)用量(ml)终浓度(比色时)0.05mol/L 磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol/L 750μmol/L NBT溶液0.375μmol/L 100μmol/L EDTA-Na2液0.310μmol/L 20μmol/L 核黄素0.320μmol/L 酶液0.052支对照管以缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.0混匀后将1支对照管置暗处,其它各管于4000Lx日光下反应20min(要求各管受光情况一致,温度高时间缩短,低时延长)。 3. SOD活性测定与计算 至反应结束后,以不照光的对照管做空白,分别测定其它各管的吸光度。四、结果计算 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示,按下式计算SOD活性。SOD总活性=(Ack-AE)×V/(Ack×0.5×W×Vt) 上式中,SOD比活力=SOD总活性蛋白质含量式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示;比活力单位以酶单位/mg蛋白表示Ack照光对照管的吸光度AE样品管的吸光度V样品液总体积(ml)Vt测定时样品用量(ml)W样鲜重(g)蛋白质含量单位为:mg蛋白/g鲜重。
一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此,制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。二、蛋白质含量测定方法 1. 凯氏定氮法2. 双缩脲法3. Folin-酚试剂法4. 紫外吸收法5. 考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作 (一)试剂: 1. 考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇,加入100 ml 85% H3 PO4 ,雍蒸馏水稀释至1000 ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4.7%(W/V)乙醇,8.5%(W/V)H3 PO4 。2. 标准蛋白质溶液:纯的牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0.15 mol/LNaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。(二)器材: 1. 722S型分光光度计使用及原理。2. 移液管使用。(三)标准曲线制作: 1. 试管编号0123456100ug/ml标准蛋白(ml)0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/L NaCl (ml)10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂 (ml)5555555摇匀,1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm2. 以A595nm 为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。(1)利用标准曲线查出回归方程。(2)用公式计算回归方程。(3)或用origin作图 ,测出回归线性方程。即A595nm =a×X( )+6;一般相关系数应过0.999以上,至少2个9以上。(4)绘图时近两使点在一条直线上,在直线上的点应该在直线两侧。(四)蛋白质含量的测定: 样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品的A595nm ,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm 值在0.1—0.05之间,所以上述样品如果A595nm 值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。(五)注意事项: 1. 玻璃仪器要洗涤干净。2. 取量要准确。3. 玻璃仪器要干燥,避免温度变化。4. 对照:用被测物质以外的物质作空白对照。蛋白质含量测定实验难度系数 0共 0 人点评打分实验材料结晶牛血清清蛋白 g—球蛋白试剂(盒)Na2CO3酒石酸钾钠蒸馏水硫酸铜钨酸钠钼酸钠磷酸硫酸锂液体溴NaOH酚酞仪器耗材可见光分光光度计旋涡混合器秒表[url=http://www.biomart.cn/equipm
RT,求5-氨基四氮唑的液相条件,或者四氮唑类的液相条件