察氏琼脂

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项目概况南宁市疾病预防控制中心实验室试剂耗材、标准物质采购（第二批） 采购项目的潜在供应商应在政采云平台（https://www.zcygov.cn/）获取（下载）获取采购文件，并于2021年12月22日 09点30分（北京时间）前提交响应文件。一、项目基本情况项目编号：NNZC2021-J1-991969-YZLZ（采购计划文号：NNZC[2021]7871号-003......具体内容详见附件招标公告项目名称：南宁市疾病预防控制中心实验室试剂耗材、标准物质采购（第二批）采购方式：竞争性谈判预算金额：97.7921000 万元（人民币）采购需求：预算金额：合计97.7921万元。A 分标 53.3652万元； B 分标 28.9772万元；C 分标15.4497万元；采购需求：A分标：项号采购标的单位数量简要技术需求或者货物要求1单通道病毒核酸检测类试剂盒(国产)(肠道病毒等)盒9具体详见采购文件《第二章 采购需求》2双通道病毒核酸检测类试剂盒(国产)(包括流感病毒、肠道病毒等)盒343新型冠状病毒2019-nCOV核酸定值质控品支354病毒DNA/RNA提取试剂盒（预封装）盒1085无RNase10µl带滤芯长吸头盒106无RNase250µl长吸头（带滤芯）箱870.1ml八连排定量管（带盖）箱28封口袋（透明）包1009封口袋（透明）包10010G1型消毒剂浓度试纸盒101196孔透明PCR板（适用于ABI)箱41296孔PCR板封口膜箱313N95防护口罩只120014VITEK细菌鉴定卡（ANC)盒115VITEK细菌鉴定卡（BCL)盒316API生化鉴定条（链球菌）盒117弯曲菌培养检测试剂（双孔滤膜法）盒418Karmali选择性平板盒419甘露醇卵黄多粘菌素琼脂平板瓶1020Baird-Parker琼脂平板瓶1021PALCAM琼脂基础瓶622PALCAM琼脂冻干配套试剂盒2023CIN-1培养基基础瓶224CIN-1培养基配套试剂盒825改良Y琼脂瓶226含铁牛奶琼脂瓶227甘露醇卵黄多粘菌素琼脂基础MYP瓶428查氏琼脂培养基瓶129改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤基础（MLST）瓶430万古霉素（改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤配套试剂）盒431改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（mLST-Vm肉汤）盒232脑心浸萃琼脂培养基瓶133脑-心浸萃液态培养基（BHI）瓶234改良克氏双糖铁琼脂瓶235KF链球菌琼脂培养基瓶236胆汁液态培养基瓶237改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基（mPDA）瓶238PCFA培养基基础瓶239PCFA培养基配套试剂盒440改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基配套试剂盒441葡萄糖肉浸液肉汤瓶142尿素盒343氰化钾对照管(KCN)盒244改良CCD琼脂基础(mCCD)瓶245改良CCD琼脂添加剂盒1046改良Skirrow氏琼脂基础瓶247改良Skirrow琼脂添加剂盒1048L-shaped Cell Spreader(一次性L棒)盒1049152唐菖蒲伯克霍尔德氏菌核酸快速检测试剂盒盒1氯化镁孔雀绿肉汤（MM）瓶609带盖离心管

透射电子显微镜是使用较为广泛的一类电镜，具有分辨率高、可与其他技术联用的优点。已广泛应用于医学、生物学等各个研究领域，成为组织学、病理学、解剖学以及临床病理诊断的重要工具之一。常规电镜样品制备包括常温化学双固定、常温脱水包埋、常规超薄切片、普通电镜观察几个步骤。样品制备过程历时约一周，超薄切片经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，电镜观察。所有操作均按照以下流程进行。一、试剂0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液Na 2 HPO 4 2H 2 O 35.61 g 或Na 2 HPO 4 7H 2 O 53.65 g / Na 2 HPO 4 12H 2 O 71.64 gNaH 2 PO 2 H 2 O 27.60 g 或NaH 2 PO 4 2H 2 O 31.21 g加双蒸水（ddH2O）到1000 mL0.1 mol/ L磷酸盐缓冲液（PBS）0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液 250 mL加双蒸水到500 mL2 % 低温琼脂低温琼脂 1.0 g加双蒸水到 50 mL加热到沸腾，溶液均匀后备用1 % 戊二醛固定液25 %（m/v）戊二醛水溶液 2 mL0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液 25 mL加双蒸水到50 mL1 % 锇酸固定液2 %（m/v）锇酸水溶液 10 mL0.2 mol/ L磷酸盐缓冲液 10 mL包埋剂A液Epon 812 树脂 50 mL十二烷基琥珀酸酐（modecenyl succinic anhydride, DDSA） 80 mL包埋剂B液Epon 812 树脂 50 mL六甲酸酐（methyl nadic anhydride, MNA） 44.5 mL2 ， 4 ， 6 - 三甲氨基甲基苯酚（ 2, 4, 6 - tridimethylamino methyl phenol, DMP-30 ）甲苯胺蓝染液甲苯胺蓝 1 g1 mol/ L NaOH 10 mL加双蒸水到50 mL混匀过滤后使用1 % 醋酸双氧铀染液醋酸双氧铀 0.2 g加双蒸水到10 mL封口膜封口，4℃避光保存1 % 柠檬酸铅染液硝酸铅 0.265 g柠檬酸钠（含2分子结晶水） 0.352 g加双蒸水到10 mL①① 配制铅染液时，要先加水6 mL，超声震荡30 min，使乳白色柠檬酸铅悬液充分混匀。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃动，直至溶液变清亮。最后定容至10 mL。② 细胞样品处理和藻类及其他游离样品处理流程可相互参照，即细胞样品可以酌情使用琼脂铸模法取材固定，藻类及其他游离样品也可以使用血清预包埋法取材固定，总体视样品密度及其对于温度的耐受等条件而定。封口膜封口，4℃保存仪器修块机 Leica EM TRIM切片机 Leica EM UC6光学显微镜 Nikon 80i 及配套拍照系统DS-L1透射电子显微镜 JEOL-1230Gatan Bioscan Camera 792低电压透射电子显微镜 JEM-1230二、实验流程一、 取材与固定A. 植物样品1. 自来水冲洗表面泥尘后，使用灭菌水清洗2-3次，置于铺有预湿滤纸的培养皿中。2. 使用干净锋利的刀片切取目标材料，所取材料体积不大于3 mm3。切取样品时应注意动作迅速、减小损伤，避免来回切拉；使用的灭菌水及器具应4℃预冷，并在操作中尽量保持低温以降低组织细胞活性。3. 将切下材料放入装有预冷的戊二醛固定液的青霉素小瓶中后抽气，抽几次后轻摇小瓶，并打开瓶盖。重复2-3次，直到样品沉入瓶底。4. 室温静置1h，或摇床轻摇1h。5. PBS清洗3次，10min/次。6. 1%锇酸固定液固定1h。7. PBS清洗3次，10min/次。B. 动物样品1. 4℃预冷生理盐水冲洗组织块，迅速切取组织块，体积不大于3 mm32. 将切取的组织块投入装有预冷戊二醛固定液的青霉素小瓶中，并抽气直至样品沉底。3. 室温静置1h，或摇床轻摇1h。4. PBS清洗3次，10 min/次。5. 1%锇酸固定液固定1 h。6. PBS清洗3次，10 min/次。C. 单层培养细胞或悬浮培养细胞样品②1. 3000 rpm离心5 min，收集细胞样品，尽量多的吸弃培养液上清。2. 加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4 min，3000 rpm离心5 min，吸弃上清。① 配制铅染液时，要先加水6 mL，超声震荡30 min，使乳白色柠檬酸铅悬液充分混匀。然后滴加1 mol/L NaOH，并不是晃动，直至溶液变清亮。最后定容至10 mL。② 细胞样品处理和藻类及其他游离样品处理流程可相互参照，即细胞样品可以酌情使用琼脂铸模法取材固定，藻类及其他游离样品也可以使用血清预包埋法取材固定，总体视样品密度及其对于温度的耐受等条件而定。3. 重复步骤2一次。4. 加入预冷的血清或蛋清，充分吹吸混匀，3000 rpm离心10 min，吸弃大部分上清，留少部分，吹吸悬浮沉淀细胞。（或离心后吸弃上清，留少部分上清，不悬浮沉淀细胞，视样品浓度而定）5. 缓慢加入戊二醛固定液，小心放入4℃冰箱，固定过夜。6. 吸弃上清，刀片小心划开离心管壁，用钳子拉开离心管，小心取出已凝成固体的血清包埋块。7. 使用干净的单面刀片或手术刀，将血清包埋块切成2 mm3左右的小块，取3-5个富集细胞样品效果较好的包埋小块继续下面实验。8. PBS清洗3次，10 min/次。9. 1%锇酸固定液固定1 h。10. PBS清洗3次，10 min/次。D. 藻类及其他游离培养样品1. 吸取2%低温琼脂液200μL到0.2mL离心管，并将离线管置于冰上，取10μL枪头迅速插入琼脂中并保持离心管竖直，且枪头竖直靠中的包裹在琼脂中。2. 静置1 min，待琼脂凝固后，小心拔出枪头，形成琼脂空腔，待用。3. 3000 rpm离心5 min，收集样品，尽量多的吸弃培养液上清。4. 加入4℃预冷PBS液，充分吹吸混匀，静置4min，3000 rpm离心5min，吸弃上清。5. 重复步骤2清洗，吸弃大部分上清，留极少部分上清液，吹吸悬浮样品。6. 使用10μL 移液器小心将样品加入已经制备好的琼脂空腔中，使样品充满空腔大部分，添加过程中尽量避免气泡出现。7. 吸取50μL溶化的琼脂，快速滴加到空腔琼脂上封口，冰浴5 min，待琼脂完全凝固。8. 使用单面刀片小心划开离心管壁，用钳子拉开离心管，小心取出已凝成固体的琼脂包埋块，稍作修葺。9. PBS清洗3次，10 min/次。10. 1%锇酸固定液固定1 h。11. PBS清洗3次，10 min/次。二、 脱水1. 按丙酮与灭菌水体积比3：7配制30%脱水剂。吸弃样品管/瓶中的PBS，快速加入现配的脱水剂（脱水换液过程禁止出现样品暴露空气中现象，可不全部吸完，略有剩余，使样品浸润；动作应迅速准确），室温放置或摇床轻摇45 min。加入按30%、50%、70%、90%、100%（v/v）的浓度梯度进行脱水。2. 配制50%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。3. 配制70%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。4. 配制90%脱水剂，快速换液，室温轻摇45 min。5. 使用纯丙酮快速换液，室温轻摇30 min③。6. 重复步骤5一次。三、 渗透包埋在此步脱水操作完成后即可开始配制渗透用包埋剂，以免安排不周。样品浸泡在纯丙酮中时间不宜过久，以免造成样品较脆，不利于超薄切片。1. 配制渗透用树脂包埋剂1) 取干净的10 mL注射器，拔去活塞，用封闭针头堵住注射口，放于通风橱中。2) 小心倾倒B液9 mL到注射器中；然后再小心倾倒A液1 mL。3) 插入活塞，堵住注射器后，颠倒摇匀至液体颜色均匀，无丝状液体。4) 小心拔去活塞，通风橱中操作，缓慢滴加14滴DMP-30。5) 插入活塞，堵住注射器后，颠倒摇匀至液体颜色完全均匀，无丝絮状分色，竖直放置待用。2. 按照包埋剂与丙酮体积比3：7配制30%渗透剂，快速吸弃样品管中纯丙酮并加入渗透剂，轻摇渗透3 h。3. 按照包埋剂与丙酮体积比7：3配制70%渗透剂，快速换液，轻摇渗透过夜。4. 重新配制包埋剂，并小心推按注射器，将包埋剂挤到包埋模具中至液面略凸。5. 解剖针挑取样品到纯包埋剂中，渗透3 h。6. 小心挑取样品，滤纸上稍微沾下吸弃部分粘附的包埋剂，轻轻放置到未渗透过样品的包埋孔中，小心将样品按到底，摆放好位置。记录各样品对应包埋块编号。7. 梯度温度聚合包埋1) 37℃烘箱中12 h，期间定时观察样品有无漂移现象，如有，则再次小心摆放样品位置。2) 45℃烘箱中12 h。3) 60℃烘箱中24 h。四、 修块与切片1. 拿到包埋块后检查样品位置是否得当，选取位置好的包埋块优先进行修块、切片。2. 粗修包埋块1) 使用六角扳手将包埋块固定在样品头上，露出长度合适。2) 将样品头固定在修块机上，体视镜观察修块，分四个方向将包埋块头部多余的包埋剂修去，暴露出组织块。3) 使用锋利的单面刀片修去组织块周围毛刺的包埋剂，使其四边光滑清晰。4) 卸下样品头装至切片机上，使用玻璃刀修片，直至样品表面光滑清晰。3. 半薄切片1) 将粘有水槽的玻璃刀装至切片机刀台上，体视镜下小心对刀，不时转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的距离相等。2) 转动手轮，使整个样品高于刀刃，点控制面板Start，设置切片区域上边界；转动手轮，使整个样品低于刀刃，点控制面板End，设置切片区域下边界。3) 手动步进刀台靠近样品，至出现彩色干涉光，继续步进刀台，并通过体视镜观察干涉光谱变化，直至干涉光消失。4) 转动手轮，使样品离开刀刃区域，使用滴管将干净的去离子水加到玻璃刀水槽中，体视镜观察直至液面略低于刀刃。5) 调整切片厚度与速度，按控制面板Run/Stop键，开始切片。体视镜观察可见900nm厚度切片反光为亮绿色。6) 待有切片下来形成4-6片的切片带，按Run/Stop键停止切片，体视镜观察下，使用睫毛笔将所需薄片拨离刀刃，并将所需切片聚拢一起。7) 用干净捞片环轻轻沾取切片所在区域，根据水膜表面张力捞取切片，放到干净载玻片上，酒精灯略微加热，使水蒸干，并对着光亮用记号笔标示切片所在位置。4. 半薄切片染色1) 吸取20μL甲苯胺蓝染液，滴加到载玻片放有切片的位置，室温静置30 s 。2) 去离子水冲洗玻片，直至不再有蓝色。吸水纸上沥干，酒精灯略微加热，加速切片上的水分蒸发。3) 显微镜观察切片质量和样品位置。5. 精修包埋块1) 移去装有水槽的玻璃刀，取下装有包埋块的样品头，装至修块机上。2) 根据半薄切片结果，使用新的锋利刀口，小心修理包埋块四边，使其尽可能的光滑、平整。6. 超薄切片1) 将钻石刀装至切片机刀台上，体视镜下小心对刀，不时转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的距离相等。2) 转动手轮，使整个样品高于刀刃，点控制面板Start，设置切片区域上边界；转动手轮，使整个样品低于刀刃，点控制面板End，设置切片区域下边界。3) 手动步进刀台靠近样品，至出现彩色干涉光，转动手轮，使样品上下移动，调整刀台左右角度及样品上下角度，直至包埋块整个表面与刀刃的干涉光谱颜色一致；继续步进刀台，并通过体视镜观察干涉光谱变化，直至干涉光消失。4) 转动手轮，使样品离开刀刃区域，使用滴管将干净的去离子水加到玻璃刀水槽中，体视镜观察直至液面略低于刀刃。5) 调整切片厚度与速度，按控制面板Run/Stop键，开始切片。体视镜观察可见70nm厚度切片反光为亮灰色及浅灰色。6) 待有切片下来形成10-20片的切片带，按Run/Stop键停止切片，体视镜观察下，使用睫毛笔将所需薄片拨离刀刃，并将所需切片聚拢一起。7) 用干净捞片环轻轻沾取切片所在区域，根据水膜表面张力捞取切片，轻轻放到干净载膜铜网上，用尖角滤纸靠近铜网边缘缓慢吸干水分。8) 轻轻移去捞片环，将载有切片的铜网放到铺有滤纸的平皿中，晾干待染色观察。五、 染色1. 醋酸双氧铀染色1) 按每片载网20μL染液的量吸取醋酸双氧铀染液，13 200 rpm离心5 min。2) 将放有切片的载网小心放到染色盘上，有切片面靠上，并稍微用镊子按载网边缘，使其与染色盘接触粘附牢固。3) 吸取20μL染液滴加到载网上面，盖上平皿防尘，室温染色30 min。4) 将染色盘整个放到装有去离子水的清洗缸中，轻摇清洗1 min。5) 小心取出染色盘，更换水洗液，轻摇清洗5min。6) 重复清洗2次。2. 柠檬酸铅染色1) 按每片载网20μL染液的量吸取醋酸双氧铀染液，13 200 rpm离心5 min。④2) 在放置染色盘的平皿中放入2片固体NaOH，用以吸收平皿中CO2气体。3) 吸取20μL染液滴加到载网上面，盖上平皿防尘，室温染色8 min。4) 将染色盘整个放到装有去离子水的清洗缸中，轻摇清洗1 min。5) 小心取出染色盘，更换水洗液，轻摇清洗5min。连续染色时，载网不需要从染色盘上拿下，清洗后直接进行铅染即可，但是铅染液要现用现取。6) 重复清洗2次。7) 小心夹取载网，放置到铺有滤纸的干净平皿中，晾干待电镜观察。六、 电镜观察1. 取出样品杆，打开样品夹，小心放入载网，合上样品夹，并转动样品杆，轻敲确保样品夹已准确固定载网。2. 将样品杆插入透射电镜样品室，开始抽气。3. 打开灯丝开关，等待检测电流出现后，打开观察窗开始观察。4. 先在低倍下找到切片，再高倍观察切片，寻找待看目标，仔细对焦。5. 将切片目标区域遇到观察窗中间后，调整灯丝电流密度为3.8 pA/cm2。6. 插入拍照CCD，Start View，微调焦距，Start Acquire 拍照。7. 拍照完毕，按格式需求保存照片到指定文件夹。8. 使用专用写保护闪存盘拷贝数据到公共电脑观察、使用。三、应用领域1、材料领域材料的微观结构对材料的力学、光学、电学等物理化学性质起着决定性作用。透射电子显微镜作为材料表征的重要手段，不仅可以用衍射模式来研究晶体的结 构，还可以在成像模式下得到实空间的高分辨像，即对材料中的原子进行直接成像，直接观察材料的微观结构。