乳酸乳球菌

随着微生态学研究的不断发展，乳酸菌功能的进一步开发，越来越多的实验证明乳酸菌对人体健康有重要的作用，如改善胃、肠道菌群结构、预防肠道疾病、抑制病原菌生长、降低血清中胆固醇含量、提高机体免疫力、治疗脚气病、消除致癌因子、防衰老及延年益寿等。因此，近年来，乳酸菌被广泛应用于发酵乳制品行业。如在改善酸奶的风味方面，可以在发酵过程中增加一些能够改善酸奶风味的有益菌种：如丁二酮乳链球菌、醋化醋杆菌、肠膜明串珠菌及乳酪链球菌等；在提高酸奶的功能性方面，可以添加生物源功能因子———益生菌群，如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等。但是，如何鉴定乳制品中是否含有加入的这类乳酸菌，以及含有哪一种或几种乳酸菌，一直是人们关注的问题。目前，已有一些关于嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等分选计数的报道，但大多基于它们纯培养的基础上，没有得到充分研究。本文对酸乳中多肽物质进行测定、分析与比较，找出不同的乳酸菌发酵酸奶时产生的活性多肽的特异性，并对6种市售酸乳中所含乳酸菌进行测定。 1 试验材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试材料 酸乳：市售，不同厂家的6 种酸乳分别标号为1＃、2＃、3＃、4＃、5＃、6＃，并且均为原味凝固型，生产日期相同的合格产品，均添加有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。其中只有1＃ 酸奶中添加了1 种新菌种。 1.1.2 主要试剂与药品超低分子量SDS-PAGE电泳Marker，分子量分别为20100、14400、7823、5856 u 和3313 u；多肽标准品；丙稀酰胺(Acr)；甲叉双丙稀酰胺(Bis)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)；十二烷基磺酸钠(SDS)；四甲基乙二胺(TEMED)；过硫酸铵(AP)；三羟甲基甘氨酸(Tricine)；甘油；考马斯亮蓝G-250；巯基乙醇；聚乙二醇6000等。 1.1.3 主要仪器与设备TGL-16M 高速台式冷冻离心机，分子量1000 u 透析袋，Hoefer mini VE电泳槽，电泳仪、显微摄影系统，50 μL 微量进样器，PHS-3C 酸度计，超净工作台，电子天平，电热恒温培养箱，显微镜，电热恒温水浴锅，电热鼓风干燥箱等。 1.2 试验方法及参数确定 1.2.1 市售酸乳中多肽物质的提取离心除杂：分别取刚打开包装的新鲜市售酸乳样品各50 mL，然后于8000 r/min、4 ℃条件下冷冻离心20 min，取上清液。透析：取上清液置分子量1000 u 透析袋中，用蒸馏水于4 ℃冰箱中透析48 h，其间每隔4 h 更换1 次透析液。浓缩：用聚乙二醇6000 浓缩至原体积的1/3，即得到待检测多肽样品。 1.2.2 酸乳中多肽物质的检测Tricine -SDS -PAGE 电泳法。适合小肽分析的方法有很多，例如毛细管电泳、高效液相色谱、质谱、离子交换色谱、SDS-PAGE 电泳等。由于SDS-PAGE 电泳法对样品纯度要求不是很高，以及实验室条件等各因素限制， 最终采用适用于小肽分析的SDS -PAGE-Tricine 系统对水溶性多肽进行种类和分子量分析。通过大量试验，最终确定的电泳参数为：上样量为10 μL；凝胶浓度分别为：浓缩胶浓度4%，分离胶浓度15%；电流选择：浓缩胶时18 mA，分离胶时25 mA。 1.2.3 电泳后多肽的染色考马斯亮蓝G－250 染色液。 2 结果讨论 http://www.hopebiol.com/asphtml/admin/kindeditor/attached/image/20150206/20150206163557695769.png图1 是市售酸乳中多肽的电泳图谱，虽然有一点条带畸形和拖尾现象，但仍然可以较为清晰地数出多肽条带数。从电泳图谱中可以看出，这6 种酸乳都含有分子量低于7823 u 的小分子量物质，并且6 种酸奶的活性多肽在保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的特征谱带处都有谱带，其中2＃ 还含有分子量在3313~5856 u 之间的4 种肽类，但条带颜色很浅，可知其含量很低，这很可能是因为其添加了不同菌种的缘故。从迁移率上看，虽然6 种产品所含肽类基本相同，但从颜色深浅来定性的分析，其肽类含量还是有差异的。 3 结论酸乳中肽类物质产生的种类和含量与发酵菌种有着直接的关系。同时由于不同厂家生产条件的差异导致含量上的轻微差别，这主要体现在相同迁移率谱带的颜色深浅上。本文对6 种市售酸乳中多肽物质进行测定、分析与比较，结果表明，6 种酸乳的活性多肽在保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌的特征谱带处都有谱带，即该6 种市售酸乳中均含有保加利亚乳杆菌和嗜热乳链球菌，与其配料中所添加菌种一致。

1 目的要求（1）初步掌握乳酸菌活力测定的一般方法。（2）了解乳酸菌在乳发酵过程中所起的作用。2 基本原理乳酸菌的细胞形态为杆状或球状，一般没有运动性，革兰氏染色阳性，微需氧、厌氧或兼性厌氧，具有独特的营养需求和代谢方式，都能发酵糖类产酸，一般在固体培养基上与氧接触也能生长。酸乳风味的形成与乳酸菌发酵过程代谢的多种物质有关，而这些物质的产生与发酵速度等活力指标有密切关系。乳酸菌的活力可由多种参数确定，如细胞生长情况，细胞干重和光密度（OD值）等。由于乳液不透明，不能直接测OD值，可用NaOH和EDTA处理使其澄清后再测。较简便的活力测定包括凝乳时间，产酸和活菌数量等指标的检测。3 实验材料3．1样品 市售酸奶或乳酸菌饮料。3．2 培养基 MRS固体和液体培养基，复原脱脂乳培养基。3．3 实验用仪器设备 超净工作、恒温培养箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、油镜显微镜、碱式滴定仪、天平、培养皿、移液管、试管、烧杯、量筒、温度计、酒精灯、接种针、载玻片等。4 实验方法与步骤4．1 菌种的分离（1）编号 取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2～10-5。（2）稀释 将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25mL，移入含有225mL无菌水的三角瓶中，在漩涡混合器上充分振摇，使样品分散均匀，获得10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当稀释度。（3）倒平板 选用2～3个适宜浓度的稀释液，分别吸取1mL注入平皿内，然后倒入事先溶化并冷却至45℃左右的MRS固体培养基，迅速转动平皿使之混合均匀，待冷却凝固后倒置，于40℃培养48h。（4）分离 无菌操作，从培养好的固体平皿中分别挑取5个单菌落接种于液体MRS培养基中，置40℃培养箱中培养。（5）镜检 通过镜检，确定所分离的乳酸菌是乳杆菌还是链球菌。保加利亚乳杆菌呈杆状，单杆、双杆或长丝状；嗜热链球菌呈球状，成对、短链或长链状。4．2 接种按1%的接种量，将MRS液体培养物接种于已灭菌的复原脱脂乳中，另分别接种具有较高活力的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌作为对照。培养温度为保加利亚乳杆菌40℃， 嗜热链球菌45℃。4．3 观察与测定（1）观察： 观察并记录各试管的凝乳时间。（2）酸度测定：用NaOH滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度。（3）计数：采用倾注平板法，测定活菌数量。

【序号】：4【作者】： 卢毅飞邓君王竞【题名】：乳酸乳球菌温敏水凝胶对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响及其机制【期刊】：中华烧伤杂志. 【年、卷、期、起止页码】：2020,36(12)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=CJFD&dbname=CJFDZHYX&filename=ZHSA202012044&uniplatform=NZKPT&v=qyaaPKggepGp2i48QFbRV6y-8E8KHCZskOCUhbnUh7PMDkFUs0xFyMEv-SpofRuG