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[font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]是一种将[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。该技术通过将动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合,产生永生化杂交瘤细胞系,然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆,并进一步循环亚克隆以产生严格的单克隆抗体。[/font][/font][font=宋体][font=宋体][b]利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为[/b]:抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。(详细实验流程:杂交瘤单克隆抗体制备[/font][font=Calibri]SOP[/font][font=宋体])在单克隆抗体制备过程中,常常会遇到细胞污染,细胞融合后不生长、亚克隆后的细胞株不分泌抗体以及细胞难以克隆等问题,本文将详细分析以上常见问题的产生原因以及解决该问题的方法。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一、微生物污染[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]①细菌、真菌污染主要是由于实验人员操作不当或者消毒不到位引起的。人身上可能携带各种孢子,如果操作不当,或者是未能及时到位的消杀,就有可能会引入污染。除此之外,还须注意平时使用的一些消毒剂,比如[/font][font=Calibri]84[/font][font=宋体]消毒液或者[/font][font=Calibri]75%[/font][font=宋体]酒精,要确认它的纯度以及质量。如果是因为这些问题导致的消毒不到位,是非常不容易发现的。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]②支原体污染则可能由血清制品、关键试剂材料或实验人员带入。正常的[/font][font=Calibri]SP2/0[/font][font=宋体]细胞圆润透亮,当被支原体污染后,短期内细胞没有明显的变化,当污染严重后,细胞生长会变得极为缓慢,生长周期变长,细胞形态多样。可通过加入商品化的清除支原体试剂,或者通过将污染的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔,待产生实体瘤后或产生腹水后,无菌分离重新获得杂交瘤细胞。[/font][/font][font=宋体]③原生生物污染主要是大家比较头疼的黑胶虫,污染后会陆续出现多少不等的小黑点。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、融合后细胞不生长[/font][font=宋体][font=宋体]①融合后细胞不生长可能是因为融合试剂有毒性,部分毒性试剂作用时间过长引起的。如[/font][font=Calibri]PEG[/font][font=宋体]在[/font][font=Calibri]10%~60%[/font][font=宋体]都可以进行融合,但浓度越高毒性越大。[/font][/font][font=宋体]②也有可能是使用血清质量比较差,推荐使用胎牛血清。[/font][font=宋体][font=宋体]③还有可能是因为添加的[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤([/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体])含量过高或[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体](次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷)含量过低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体] [/font][font=宋体]三、杂交瘤细胞不分泌抗体或者停止分泌抗体[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞不分泌抗体,可能的原因有以下几种:[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.[/font][font=宋体]抗原免疫原性弱,免疫效果不好,可以通过多方案检测血清效价进行进一步评估;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]操作过程中脾细胞损伤较多,抗原特异性淋巴母细胞大量死亡;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、杂交瘤细胞前期有抗体分泌,后期在克隆化过程中抗体分泌量减少或停止分泌抗体,可能的原因有以下几种:[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]a.HAT[/font][font=宋体]试剂中氨基喋呤([/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体])失效,骨髓瘤细胞增殖抑制杂交瘤细胞的生长;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]b.[/font][font=宋体]未及时克隆,不分泌抗体的杂交瘤大量生长挤占生存空间;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]c.[/font][font=宋体]骨髓瘤细胞返祖化,抵抗氨基喋呤([/font][font=Calibri]A[/font][font=宋体])的选择;[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]d.[/font][font=宋体]梁色体丢失(突变)[/font][font=Calibri] [/font][/font][font=宋体][font=Calibri]e.[/font][font=宋体]支原体污染。[/font][/font][font=宋体]解决方法有三种:第一,及时进行细胞建库;第二,高频次检查细胞状态和是否污染;第三,定期进行抗原筛选。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]四、杂交瘤细胞难以克隆化[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]一旦确认有分泌抗体的杂交瘤细胞,就应尽快进行克隆化。克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体,反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞若难以克隆化,可以尝试以下解决方法:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①使用已有杂交瘤细胞株对血清进行筛选,确定最佳批次的血清和使用浓度;[/font][font=宋体][font=宋体]②融合后第一次克隆(一亚)仍需采用含[/font][font=Calibri]HT[/font][font=宋体]的条件培养;[/font][/font][font=宋体][font=宋体]③在培养体系中加入白细胞介素[/font][font=Calibri]6[/font][font=宋体]([/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]),一般商品化的杂交瘤因子都含有[/font][font=Calibri]IL6[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]义翘神州提供杂交瘤测序服务和杂交瘤细胞培养及抗体生产服务,具体关于杂交瘤相关问题详情可以参看[/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体][font=宋体]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service[/font][/font][font=宋体][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service][b]杂交瘤测序服务[/b][/url]:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-sequencing-service[/font][/font]
[font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术作为生产单克隆抗体的主流方法之一,其在生物医学领域的贡献不可忽视。该技术通过免疫小鼠后分离出能够产生抗体的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞,再与永生性骨髓瘤细胞系融合,形成杂交瘤细胞,进而在实验室中培养这些杂交瘤细胞,以产生针对特定抗原的单克隆抗体。杂交瘤抗体的大量生产,既可通过体内腹水制备方法,也可通过体外摇瓶培养方法。杂交瘤技术之所以在制备单克隆抗体上备受青睐,关键在于其制备的抗体具有高纯度、高灵敏度以及高特异性。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术的不同应用[/font][/b][font=Calibri] [/font][font=宋体]一旦得到稳定的杂交瘤细胞系后,[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]该细胞系能够持续且高效地分泌出高度均一化的单克隆抗体[/font][/color][/font][font=宋体]。这种稳定的抗体生产能力不仅确保了抗体的稳定供应,而且显著降低了抗体的生产成本。由于这些抗体能高特异性和高灵敏度地识别目标抗原,因此,杂交瘤技术成为了多个研究领域的重要工具,包括毒理学、动物生物技术、医学、药理学、细胞生物学和分子生物学等。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]单克隆抗体在诊断、成像和治疗等领域具有广泛的应用。[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]在诊断领域,单克隆抗体因其高度的特异性,常用于免疫组化、酶联免疫吸附试验([/font]ELISA[font=宋体])和流式细胞术等方法中,以检测和识别特定的生物标志物。[/font][/color][/font][font=宋体]在治疗领域,很多抗体药如[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]利妥昔单抗[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]([/color][/font][font=Helvetica][color=#060607]Rituximab[/color][/font][font=宋体][color=#060607][font=宋体])、曲妥珠单抗[/font] [font=Helvetica](Trastuzumab)[/font][font=宋体]、西妥昔单抗([/font][font=Helvetica]Cetuximab[/font][font=宋体])是[/font][/color][/font][font=宋体]利用杂交瘤技术开发的,用于治疗[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]非霍奇金淋巴瘤[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]、[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]乳腺癌[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]、[/color][/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体]非小细胞肺癌和结肠癌[/font][/color][/font][font=宋体][color=#060607]等癌症。这些抗体药物的成功开发和应用,展示了杂交瘤技术在制备治疗性单克隆抗体方面的重要性,[/color][/font][font=宋体]为癌症等复杂疾病的治疗提供了新的可能性。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杂交瘤技术的局限性[/font][/b][font=Calibri] [/font][url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][u][font=宋体][color=#0000ff]杂交瘤技术[/color][/font][/u][/url][font=宋体]目前也面临一些挑战[/font][font=Helvetica][color=#060607][font=宋体],如融合效率低、产生抗体多样性有限以及可能的免疫排斥反应等[/font][/color][/font][font=宋体]。目前,大多数单克隆抗体都是在小鼠或大鼠中产生的,这增加了疾病从动物转移到人类的风险。虽然这些抗体在实验室条件下表现出色,但在实际应用中,特别是在人类疾病的治疗中,可能会引发免疫反应,影响治疗效果。因此,寻找更安全、更有效的抗体生产方法,是当前生物医学领域的重要课题。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]未来,杂交瘤技术有望在多个方面取得新的突破。一方面,通过优化杂交瘤细胞的培养条件,可以进一步提高抗体的产量和质量。另一方面,利用基因工程技术对杂交瘤细胞进行改造,可以使其产生具有特定功能或特性的抗体,从而满足更多样化的应用需求。此外,随着人工智能和大数据技术的发展,我们有可能对杂交瘤技术的各个环节进行更精准的调控和优化,从而推动其在生物医学领域的更广泛应用。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]综上所述,杂交瘤技术以其独特的优势在单克隆抗体的制备中占据了重要地位,其产生的抗体在多个领域都发挥着重要作用。然而,该技术也面临一些挑战,需要我们在未来的研究中不断探索和解决。我们有理由相信,随着科学技术的不断进步,杂交瘤技术将在生物医学领域发挥更大的作用,为人类的健康事业作出更大的贡献。[/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]本篇文章由义翘神州编辑整理,同时义翘神州提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/hybridoma-culture-antibody-production-service][u][font=宋体][color=#0000ff]杂交瘤细胞培养及抗体生产服务[/color][/font][/u][/url][font=宋体],点击了解详情![/font][font=Calibri] [/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]参考文献:[/font][font=宋体]Mitra S, Tomar PC. Hybridoma technology advancements, clinical significance, and future aspects. J Genet Eng Biotechnol. 2021 19(1):159. Published 2021 Oct 18. doi:10.1186/s43141-021-00264-6[/font]
[font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术([/font][font=Calibri]hybridoma technique[/font][font=宋体])即淋巴细胞杂交瘤技术,又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。克勒([/font][font=Calibri]Kohler[/font][font=宋体])和米尔斯坦([/font][font=Calibri]Milstein[/font][font=宋体])([/font][font=Calibri]1975[/font][font=宋体])证明,骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合,形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体,这种技术通称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代,而脾细胞是终末细胞,不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体或因子的淋巴细胞融合,则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性,又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体或因子的能力,同时也克服了免疫淋巴细胞不能在体外繁殖的缺点,融合的细胞称为淋巴细胞杂交瘤。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤技术原理及步骤:[/font][/b][font=宋体][font=宋体]杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞([/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]淋巴细胞)的主要特征是它的抗体分泌功能,但不能在体外连续培养,小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖,即具有所谓永生性。在选择培养基的作用下,只有[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力,形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]其原理从下列[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]个主要步骤阐明。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]([/font][font=宋体]一[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]细胞的选择与融合[/font][/font][font=宋体][font=宋体]建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体,所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞,通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞聚集的重要场所,无论以何种免疫方式刺激,脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖,只有肿瘤细胞才具备这种特性。选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞系恶性肿瘤,所以是理想的脾细胞融合伴侣。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤,使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇[/font][font=Calibri](PEG1 000[/font][font=宋体]~[/font][font=Calibri]2 000)[/font][font=宋体]是最常用的细胞融合剂,一般应用浓度为[/font][font=Calibri]40%(W/V)[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]([/font][font=宋体]二[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]选择培养基的应用[/font][/font][font=宋体][font=宋体]细胞融合是一个随机的物理学过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中,经融合后细胞将以多种形式出现。如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中仅存活[/font][font=Calibri]5[/font][font=宋体]~[/font][font=Calibri]7d[/font][font=宋体],无需特别筛选;细胞的多聚体形式也容易死去;而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]细胞[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]合成一般有两条途径。主要途径是由糖和氨基酸合成核苷酸,进而合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体],叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下,经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶[/font][font=Calibri](HGPRT)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶核苷激酶[/font][font=Calibri](TK)[/font][font=宋体]的催化作用合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]。细胞融合的选择培养基中有[/font][font=Calibri]3[/font][font=宋体]种关键成分:次黄嘌呤[/font][font=Calibri](hypoxanthine[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]H)[/font][font=宋体]、甲氨蝶呤[/font][font=Calibri](aminopterin[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]A)[/font][font=宋体]和胸腺嘧啶核苷[/font][font=Calibri](thymidine[/font][font=宋体],[/font][font=Calibri]T)[/font][font=宋体],所以取三者的字头称为[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基。甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂,可阻断瘤细胞利用正常途径合成[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体],而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的[/font][font=Calibri]HGPRT-[/font][font=宋体]细胞株,所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能,可在[/font][font=Calibri]HAT[/font][font=宋体]培养基中长期存活与繁殖。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]([/font][font=宋体]三[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体]有限稀释与抗原特异性选择[/font][/font][font=宋体][font=宋体]在动物免疫中,应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇,一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答实质是众多[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞群的抗体分泌,而针对目标抗原表位的[/font][font=Calibri]B[/font][font=宋体]细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程,在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体,需经筛选去除。筛选过程一般分为两步进行:一是融合细胞的抗体筛选,二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释,使分配到培养板的每一孔中的细胞数在[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]至数个细胞之间[/font][font=Calibri](30%[/font][font=宋体]的孔为[/font][font=Calibri]0[/font][font=宋体]才能保证每个孔中是单个细胞[/font][font=Calibri])[/font][font=宋体],培养后取上清液用[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]法选出抗体高分泌性的细胞;这一过程常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再进行克隆化,应用特异性抗原包被的[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株,增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]杂交瘤技术应用:[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、单克隆抗体的重要性和价值[/font][/font][font=宋体]单克隆抗体不仅在生物学和免疫学基础研究中具有重要的价值,而且在实践中的应用范围亦极为广泛。[/font][font=宋体]单克隆抗体在医学诊断中的应用[/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、在医学中,单克隆抗体已用于疾病的诊断,其优点是诊断准确,无交叉反应。[/font][/font][font=宋体]例如,单克隆抗体诊断乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒,则很少发生假阴性的漏诊。[/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、单克隆抗体作为药物载体的应用[/font][/font][font=宋体]单克隆抗体对靶组织有专一亲和性,故在体内有特异定位分布的特点。[/font][font=宋体]把抗肿瘤药物和抗某种肿瘤的单克隆抗体结合,则可使药物在体内有选择地集中向该肿瘤细胞攻击,只杀灭靶细胞,而不损伤正常组织,大大减轻了抗癌药物的副作用。[/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、单克隆抗体在治疗中的挑战和未来的发展方向[/font][/font][font=宋体][font=宋体]制做的单克隆抗体多为鼠[/font][font=宋体]——鼠型,对人来说属异种蛋白质,因此难于用于治疗。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]更多详情可以查看[url=https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology][b]杂交瘤技术[/b][/url]:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/resource/antibody-technical/hybridoma-technology[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州:蛋白与抗体的专业引领者,欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]