酸性橙标准品

食品中酸性橙Ⅱ号的检测1、 检测依据：SN/T 3536-2013 《出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法》 ；[color=#333333]DBS22/ 006-2012 食品安全地方标准 食品中酸性橙、碱性橙2和碱性嫩黄的测定 液相色谱-串联质谱法[color=red][/color][/color][color=#333333][/color][table][tr][td] [/td][td]2、适用基质：腐竹、腐皮、豆腐干、海鱼、辣椒及其制品、花椒及其制品等仪器：Waters E2695；进样体积（μl）：50；定容体积（ml）：5； [color=#000000]波长（nm）：484[/color]； 流动相（流速1ml/min）；甲醇∶乙酸铵（0.02mol/L）=65:353、检测流程：[img=,690,467]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810172023287807_3006_2166779_3.png!w690x467.jpg[/img]说明：1）DBS22/006-2012方法采用甲醇+甲酸+乙酸铵溶液超声提取，过WAX固相萃取柱净化后，用提取液定容。本流程使用色素液相的前处理方法。 2）若试样为液体则不用提取，直接调pH后过聚酰胺小柱； 3） 糖果样品直接用水提取（若不好溶解则将糖果放在水中加热溶解）；提取液调pH后过柱；淀粉类等含水量较低的样品用提取液重复提取3次；奶茶等蛋白质含量较高的液体样品称样后加入少量水并用水浴加热，可直接过柱； 4） 柠檬酸溶液放置一段时间易产生絮状沉淀，使用前应注意观察，溶液有效期改为2个月，到期应及时重新配置。 5）试样溶液只能用0.45μm水相滤膜过滤，尼龙的过滤头会吸附色素； [b]酸性橙Ⅱ标液图谱 [img=,690,479]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810172037368025_1893_2166779_3.png!w690x479.jpg[/img]辣椒样品色谱图：[img=,690,529]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810172046298209_3156_2166779_3.png!w690x529.jpg[/img]4、系统适应性参数[/b]色谱柱：C[sub]18[/sub]柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5mm理论塔板数：12958 USP拖尾：1.08[b]5、线性范围、线性方程[/b]分别对酸性橙Ⅱ号标准系列工作溶液进行测定，以酸性橙Ⅱ号标准溶液的质量浓度(μg/mL)为横坐标，酸性橙Ⅱ号峰面积为纵坐标，绘制标准曲线或计算回归方程，具体结果见下图。 [img=,650,583]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810172037477486_6020_2166779_3.png!w650x583.jpg[/img][b]6、方法的回收率、精密度1）方法的回收率实验 [/b]取辣酱样品，做三个浓度水平的标准加入回收实验，称取样品后分别加入酸性橙Ⅱ号0.5μg、1.0μg和5.0μg均按本方法做6次平行测定。结果见下表.[img=,690,197]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810172039577469_7208_2166779_3.png!w690x197.jpg[/img][b]2 ）方法的精密度实验[/b]取政东辣酱样品，精密称取6份，按标准方法处理，进行平行测定。结果见下表。[img=,690,231]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810172041485257_1161_2166779_3.png!w690x231.jpg[/img] [img=,690,530]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810172049444289_4083_2166779_3.png!w690x530.jpg[/img] [img=,385,176]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810172050275859_6160_2166779_3.png!w385x176.jpg[/img][img=,690,320]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810172042289237_3688_2166779_3.png!w690x320.jpg[/img][/td][/tr][/table]

[align=center][img=,600,475]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/12/201912251150070539_3134_932_3.jpg!w356x282.jpg[/img][/align]非食用着色剂酸性橙Ⅱ，Acid Orange 7，染料索引号：C.I. 15510，是一种常用的工业染料，有强致癌性。因其色泽鲜艳、匀染性好、价格低廉等特点，酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用于食品生产加工，因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用着色剂的检测范围。目前，国家已经发布3个推荐性的食品中酸性橙Ⅱ专用检测标准，但由于不同实验室间仪器、人员、实验耗材、样品等条件存在差异，完全执行方法就能达到回收率、精密度要求的情况很少。因此，根据实际情况进行方法的优化是必要的。最近，小编在用不同的基质按照标准《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法》做酸性橙Ⅱ回收实验时，发现回收率不很理想，而且6.1.2所规定的固态样品前处理方法非常耗时（特别是净化前提取液需“浓缩约至10mL”这一步）。因此小编依据标准方法对不同实验环节进行了一些优化，在这里将全过程分享给各位朋友以供参考交流~[align=center][size=16px][b]样品净化步骤[/b][/size][/align][align=left]样品净化步骤优化涉及[b]SPE小柱与滤膜的选择[/b]、[b]固相萃取操作步骤[/b]。[/align][align=left]首先，我们需要按标准方法进行实验，验证所用SPE小柱与滤膜是否满足当下实验条件需求：[/align][align=left][b]1. 根据标准3.6节（见下图）选择对应的SPE小柱。[/b][/align][img=,600,45]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/12/201912251151252979_312_932_3.png!w690x52.jpg[/img][align=left]由此，小编选择了月旭Welchrom NH2小柱（500mg/6ml,30pk，货号：00509-11006）。[/align][align=left][b]2. 使用酸性橙Ⅱ标准溶液，按标准6.1.3节的净化方法[/b][font=-apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]（见下图）[/color][/size][/font][b]进行固相萃取操作[/b][font=-apple-system-font, BlinkMacSystemFont, &][size=15px][color=#333333]（小柱的活化方法见3.6）[/color][/size][/font][b]，留取每一操作步骤的样液用于上机检测。[/b][/align][align=center][b][img=,600,111]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/12/201912251152154343_6193_932_3.jpg!w558x104.jpg[/img][/b][/align]在这里，小编移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ标准溶液，加10mL水混匀作为上样溶液,并根据6.1.3分别收集上样液、淋洗液、洗脱液、二次洗脱液进行上机检测（此方法又称“分步留样”，是分析SPE操作过程中影响回收率的环节及原因的常用方法）。[b]3. 选择合适的滤膜过滤样液，上机检测。[/b]根据6.1.3，样液上机前要过膜净化。我们都知道，滤膜作用是净化样液，防止杂质污染色谱柱。但使用滤膜（或使用不合适的滤膜）可能会影响目标物的回收率甚至引入杂峰。因此，小编尝试了三种过膜方式：1) 不过膜；2) 水系滤膜；3) Nylon滤膜。[align=center][img=,600,218]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/12/201912251153185149_6941_932_3.jpg!w690x251.jpg[/img][/align][color=#a0a0a0]蓝色为样液不过膜，峰面积12.0191[/color][color=#a0a0a0]粉色为样液过水系滤膜，峰面积11.4695[/color][color=#a0a0a0]黑色为样液过Nylon滤膜，峰面积6.4975[/color]结果发现过膜后，过膜样液的图谱峰面积：过Nylon滤膜＜过水系滤膜＜不过膜，说明过水系膜或有机系膜都对目标物造成一定损失。因此后续实验的样液均不过膜上机。建议本实验样液上机前不过膜。[align=left]最后，小编发现上样液、淋洗液以及两次的洗脱液中都没有目标物酸性橙Ⅱ检出，酸性橙Ⅱ最终的回收率已经达到了95%-105%，满足了检测的要求。[/align][align=center][size=16px][b]样品提取步骤优化[/b][/size][/align][align=left][b][size=12px]其次，按照标准方法小编进行了空白基质加标实验，验证样品提取步骤是否影响不同基质样品中目标物的回收。实验方法如下图所示。[/size][/b][/align][align=center][size=12px][img=,600,475]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/12/201912251155000983_2703_932_3.jpg!w664x526.jpg[/img][/size][/align]实验过程中，小编发现：6.1.2 固态试样提取方法中提及：要用20mL乙醇-氨溶液（配制方法见3.4）提取2遍，再合并提取液，浓缩至10mL。此时洗脱液总量约[b]40mL[/b]，需40℃浓缩至[b]10mL[/b]左右【相当于除去乙醇】。整个浓缩过程非常耗时，差不多处理一个样要[b]一小时[/b]，而且最终的结果回收率非常不理想。按照第一次实验的结果，小编进行了一些优化，标准上是全部提取液浓缩至10mL左右后净化，改为移取了其中20mL经浓缩至约5mL后上样。根据第二次实验结果，回收率已经达到了90%-100%，满足了检测的要求。最终优化后的实验步骤和谱图[align=center][b][size=16px][img=,600,350]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/12/201912251155541183_7553_932_3.png!w664x388.jpg[/img][/size][/b][/align][b][size=16px]一、提取[/size]称[/b]取样品2g（±0.01g）于50mL离心管中，加入20mL乙醇-氨溶液，超声提取30min，离心10min（4000r/min），吸取上清液于另一50mL离心管中；残渣中加入20mL乙醇-氨溶液，重复提取一次，合并两次上清液，混匀，准确移取20mL上清液，40℃旋转蒸发至少于5mL,转移至15mL离心管中，用水定容至10mL，待净化。[size=16px][b]二、净化[/b][/size][align=left][size=12px]SPE柱：月旭Welchrom NH2规格：500 mg/6mL[/size][/align][align=left][size=12px]活化：依次用5mL甲醇，5mL2%甲酸水溶液过柱，弃去流出液[/size][/align][align=left][size=12px]上样：将待净化液全部上样，自然流干，弃去流出液[/size][/align][align=left][size=12px]淋洗：依次用5mL2%甲酸水溶液，再用5mL甲醇淋洗小柱，弃去流出液[/size][/align][align=left][size=12px]洗脱：用5mL10%氨水甲醇溶液，收集于15mL试管中，抽干小柱[/size][/align][align=left][size=12px]浓缩：氮吹至近干，用水定容至1mL,上HPLC检测。[/size][/align][b][size=16px]三、仪器条件[/size][/b][align=left][size=12px]色谱柱：月旭UltimateXB-C18,4.6×250mm,5μm[/size][/align][align=left]流动相：乙酸铵：甲醇=35:65[/align][align=left]柱温：35℃[/align][align=left]进样量：20μL[/align][align=left]检测波长：484nm[/align][align=left]流速：1.0mL/min[/align][align=center][img=,600,322]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/12/201912251157524053_1160_932_3.jpg!w556x299.jpg[/img][/align][align=center][size=16px][b]总结[/b][/size][/align]在优化标准方法的时候：1）先选择合适的SPE小柱，用目标物标准溶液进行固相萃取操作，分步排查SPE步骤，确认小柱与标准方法是否满足具体要求；2）再按标准方法，做空白基质加标，确认前处理样品提取步骤中目标物的损失情况，分析造成目标物损失的原因及步骤，有针对性优化方法；3）接着做样品和样加标，看目标物回收率情况，优化提取量或提取次数；最后得出一个稳定的方法，保证满足标准回收率要求进行检测。