苏氨酸对照品

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  • 【每日一贴】苏氨酸

    【每日一贴】苏氨酸

    【中文名称】苏氨酸；α-氨基-β-羟基丁酸；2-氨基-3-羟基丁酸；丁羟氨酸【英文名称】threonine;α-amino-β-hydroxybutyric acid【结构或分子式】 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2012/02/201202041952_347776_1855403_3.jpg【相对分子量或原子量】119.12【熔点（℃）】左旋体255～257（分解）【性状】 无色晶体或结晶性粉末。【溶解情况】 易溶于水，不溶于无水乙醇、乙醚、氯仿。【用途】 用作营养剂和生物化学试剂。苏氨酸是必须的氨基酸，它在高等动物的体内不能合成，必须由体外供给。苏氨酸是重要的医药原料，主要用于氨基酸输液与制剂；是重要的食品添加剂，用于强化谷物、糕点、牛奶等；也是重要的饲料添加剂，用于猪等动物饲料：仔猪用量为0.85%，生长育肥猪0.68%。【制备或来源】 可由蛋白质（如酪蛋白）经水解、精制而得，或由丙烯酸衍生物中甲醇和乙酸汞合成。 采用葡萄糖核淀粉为原料，利用短杆菌、棒状菌类为菌种经过发酵后在提取得。【其他】 消旋体熔点229～230℃。【生产单位】 江西省鹰潭市生物化学制品厂；武汉化工学院

  • 基因工程构建菌种生产L-苏氨酸

    摘要 文章主要介绍以基因工程构建菌种E. coli （pTH08+prh-T04）/VT418发酵生产L-苏氨酸，在10M3发酵罐中发酵产酸8.5-9.0%；转化率39-41%；周期48-52小时。文章强调在苏氨酸发酵过程中pH值以及溶氧的控制非常重要关键词：基因工程、发酵、苏氨酸一、前言L-苏氨酸是一种必需氨基酸，按世界粮农组织的标准计算，一克食品蛋白质中含苏氨酸40mg，占全部氨基酸的11%。欧美型食品中缺少苏氨酸，补充苏氨酸就能提高食品的营养价值。配合饲料也需要苏氨酸，因此近十年来，苏氨酸生产增长了5.3倍。具统计，1990年全世界苏氨酸产量为700吨/年，1996年增加到4000吨/年，2002年则猛增至35000吨。资料显示，使用植物型饲料，成畜必需添加赖氨酸和苏氨酸，比例为10：1，而幼畜为3：1。按10：1计算,目前全世界苏氨酸的需求量不应低于5万吨/年，缺口为较大。苏氨酸的生物合成途径及代谢调控机理来看，苏氨酸和赖氨酸一样，同属天冬氨酸族氨基酸。是葡萄糖经糖酵解途径生成丙酮酸，再经三羧酸循环CO2固定反应生成四碳二羧酸，后经氨基化反应生成天冬氨酸。国内外通常用传统育种和基因工程方法来获得苏氨酸的高产菌种，传统育种目前最高产酸为2-3%。在基因工程菌方面，木柱等将解除AKⅠ和HDⅡ反馈抑制的突变株HNr59的Etr-1基因导入产苏氨酸25g/L的T-693菌株,选育出具有6种调节变异组合的转导子T-1026，相同条件下可产苏氨酸40g/L。据日本味之素公司报道，用E.coliK12菌株（AHVr＋Ile－＋Met－＋pro－）含苏氨酸合成酶操纵子基因的质粒转化E.coliK12（Thr－），积累苏氨酸13.4g/L（转化率40%），小罐发酵产酸65g/L，转化率48%。前苏联全苏工业微生物遗传育种研究所的Debabov等构建了大肠杆菌基因工程菌E.coli BKIIMB-3996 工程菌，重组质粒Pvic40中含苏氨酸操纵子的三个基因thr A, thrB, thrC，遗传标记为Sac+（能以蔗糖为碳源）， thr r （抗苏氨酸）和Hser(抗高丝氨酸)，在蔗糖为碳源的流加补料方式，最高产量为85.0 g/L。综上所述，国内外用传统育种方法的菌种产酸水平在30-40g/L；用基因工程方法的菌种产酸水平在80-90g/L。二、材料与方法1. 菌种：E. coli （pTH08+prh-T04）/VT418 (上海新立公司构建)2. 培养基配方2.1 斜面培养基(g/l)葡萄糖 2.0 NH4Cl 1.0 KH2PO4 1.5 Na2HPO4 3.5 MgSO4·7H2O 0.1琼脂 20.0 加蒸馏水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，0.8Kg/cm2灭均30分钟，冷却至50℃左右加入氨苄青霉素溶液，最终浓度为50γ/ml。2.2 摇瓶种子培养基(g/l)葡萄糖 40.0 KH2PO4 1.0 MgSO4·7H2O 0.5 (NH4)2SO4 10.0 玉米浆2.0 CaCO3 15 氨苄青霉素 50γ/ml 加自来水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，分装至500ml摇瓶，0.8Kg/cm2 灭菌30分钟，接种前加入CaCO3（121℃，60分钟灭菌，烘干）和氨苄青霉素。2.3摇瓶发酵培养基(g/l)葡萄糖 80.0 (NH4)2SO4 25.0 KH2PO4 2.0 MgSO4·7H2O 1.0MnSO4·5H2O 0.5 FeSO4·7H2O 0.5 CaCO3 30.0 加自来水溶解，调pH7.0-7.2，定容1000ml，分装至500ml摇瓶，0.8Kg/cm2 灭菌30分钟，接种前加入CaCO3（121℃，60分钟灭菌，烘干）2.4 种子罐培养基葡萄糖4% (NH4)2SO4 1% KH2PO4 0.1% MgSO4·7H2O 0.05% 玉米浆 0.2% 泡敌0.01%。加水溶解pH自然，121℃灭菌20分钟，消后定容400L。接种前加入无菌氨苄青霉素50ug/L。2.5 发酵罐培养基葡萄糖8% (NH4)2SO4 2.5% KH2PO4 0.2% MgSO4·7H2O 0.1%FeSO4·5H2O 0.05% MnSO4·5H2O 0.05% 泡敌 0.01%。加自来水溶解pH自然，121℃灭菌20分钟，消后定容5.1M3。1.0Kg/cm2灭菌20分钟。

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  • 杜马斯定氮仪测定苏氨酸中氮含量
    苏氨酸为白色斜方晶系或结晶性粉末，主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。特别是饲料添加剂方面的用量增长快速。目前国内饲料资源相对缺乏，特别是豆粕、鱼粉等蛋白质饲料的匮乏，严重地制约着畜牧业的发展。苏氨酸通常是猪饲料中的第二或第三限制性氨基酸，是家禽饲料的第三或第四限制性氨基酸，随着赖氨酸、蛋氨酸合成品在配合饲料中的广泛应用，它逐渐成为影响畜禽生产性能的主要限制性因素。本实验参照《GB 5009.5 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》使用杜马斯定氮仪对苏氨酸中氮含量进行测定。
  • 离子色谱电导检测法测定苏氨酸
    本文通过瑞士万通离子色谱仪，建立了离子色谱-电导检测器直接进样测定苏氨酸的方法。结果 最小检测限为1.8 mg/L；苏氨酸与其它阳离子同时测定时互不干扰；非离子态物质对苏氨酸的测定没有影响。离子色谱-电导检测器测定方法简单、准确，可用于苏氨酸的定量分析。
  • 人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)检测试剂盒
    人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)检测试剂盒人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)检测试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。检测范围： 规格：96T/48T使用目的：本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)含量。实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)抗原、生物素化的人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人受体TNFRSF结合丝氨酸苏氨酸激酶2(RIPK2)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度
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  • 国家市场监督管理总局批准发布《氨基酸产品和添加剂预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定》等431项推荐性国家标准和2项国家标准修改单
    国家市场监督管理总局（国家标准化管理委员会）批准《液压传动连接 金属管接头 第1部分：24°锥形》等431项推荐性国家标准和2项国家标准修改单，现予以公告。国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会2023-08-06附件相关标准如下：序号标准编号及标准名称代替标准号实施日期1GB/T 20706-2023 可可粉质量要求GB/T 20706-20062024-03-012GB/T 20705-2023 可可液块及可可饼块质量要求GB/T 20705-20062024-03-013GB/T 22427.7-2023 淀粉黏度测定GB/T 22427.7-20082024-03-014GB/T 26174-2023 厨房纸巾GB/T 26174-20102024-09-015GB/T 42957-2023氨基酸产品和添加剂预混合饲料中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸含量的测定2024-03-016GB/T 42762-2023 杯壶类产品通用技术要求2024-03-017GB/T 42821-2023 贝类包纳米虫病诊断方法2024-03-018GB/T 15000.5-2023 标准样品工作导则 第5部分：质量控制样品的内部研制2023-08-069GB/Z 42962-2023 产业帮扶 猪产业项目运营管理指南2023-08-0610GB/Z 42963-2023 产业帮扶 竹产业项目运营管理指南2023-08-0611GB/T 42893-2023 电子商务交易产品质量监测实施指南2023-12-0112GB/T 41247-2023 电子商务直播售货质量管理规范2023-10-0113GB/T 42958-2023 肥料产品使用说明编写指南2024-03-0114GB/T 42954-2023 肥料中植物生长调节剂的测定 气相色谱-质谱联用法2024-03-0115GB/T 42955-2023 肥料中总氮含量的测定 杜马斯燃烧法2024-03-0116GB/T 27021.12-2023 合格评定 管理体系审核认证机构要求第12部分：协作业务关系管理体系审核与认证能力要求2023-08-0617GB/T 27000-2023 合格评定 词汇和通用原则GB/T 27000-20062023-08-0618GB/T 1270-2023 化学试剂 六水合氯化钴（氯化钴）GB/T 1270-19962024-03-0119GB/T 667-2023 化学试剂 六水合硝酸锌（硝酸锌）GB/T 667-19952024-03-0120GB/T 669-2023 化学试剂 硝酸锶GB/T 669-19942024-03-0121GB/T 686-2023 化学试剂 丙酮GB/T 686-20082024-03-0122GB/T 684-2023 化学试剂 甲苯GB/T 684-19992024-03-0123GB/T 9722-2023 化学试剂 气相色谱法通则GB/T 9722-20062024-03-0124GB/T 603-2023 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T 603-20022024-03-0125GB/T 649-2023 化学试剂 溴化钾GB/T 649-19992024-03-0126GB/T 678-2023 化学试剂 乙醇（无水乙醇）GB/T 678-20022024-03-0127GB/T 26176-2023 家用和类似用途豆浆机GB/T 26176-20102024-03-0128GB/T 42812-2023 连作障碍土壤改良通用技术规范2024-03-0129GB/T 29344-2023 灵芝孢子粉采收及加工技术规范GB/T 29344-20122024-03-0130GB/T 22638.11-2023 铝箔试验方法 第11部分：力学性能的测试2024-03-0131GB/T 42916-2023 铝及铝合金产品标识2024-03-0132GB/T 22648-2023 铝塑复合软管、电池软包用铝箔GB/T 22648-20082024-03-0133GB/T 42817-2023 农产品产地土壤改良剂使用技术规范2024-03-0134GB/T 42819-2023 农产品产地重金属污染土壤钝化通用技术规程2024-03-0135GB/T 29490-2023 企业知识产权合规管理体系 要求GB/T 29490-20132024-01-0136GB/T 42936-2023 设施管理 过程管理指南2023-08-0637GB/T 42931-2023 设施管理 基准比较分析指南2023-08-0638GB/T 42935-2023 设施管理 信息化管理指南2023-08-0639GB/T 14699-2023 饲料 采样GB/T 14699.1-20052024-03-0140GB/T 42959-2023 饲料微生物检验 采样2024-03-0141GB/T 22260-2023 饲料中蛋白质同化激素的测定 液相色谱-串联质谱法GB/T 22260-20082024-03-0142GB/T 13882-2023 饲料中碘的测定GB/T 13882-20102024-03-0143GB/T 8381.3-2023 饲料中林可胺类药物的测定 液相色谱-串联质谱法GB/T 8381.3-20052024-03-0144GB/T 42956-2023饲料中泰乐菌素、泰万菌素、替米考星的测定 液相色谱-串联质谱法2024-03-0145GB/T 13883-2023 饲料中硒的测定GB/T 13883-20082024-03-0146GB/T 13093-2023 饲料中细菌总数的测定GB/T 13093-20062024-03-0147GB/T 12956-2023 卫生间配套设备要求GB/T 12956-20082024-03-0148GB/T 10510-2023 硝酸磷肥、硝酸磷钾肥GB/T 10510-20072024-03-0149GB/T 42828.1-2023 盐碱地改良通用技术 第1部分：铁尾砂改良2024-03-0150GB/T 42828.2-2023 盐碱地改良通用技术 第2部分：稻田池塘渔农改良2024-03-0151GB/T 42828.3-2023 盐碱地改良通用技术 第3部分：生物改良2024-03-0152GB/T 13217.7-2023 油墨附着力检验方法GB/T 13217.7-20092024-03-0153GB/T 42944-2023 纸、纸板和纸制品 有效回收组分的测定2024-03-0154GB/T 42945-2023 纸浆 细小纤维质量分数的测定2024-03-0155GB/T 42943-2023 纸浆模塑制品技术通则2024-03-0156GB/T 42748-2023 专利评估指引2023-09-0157GB/T 22461.1-2023 表面化学分析 词汇 第1部分：通用术语及谱学术语GB/T 22461-20082024-03-0158GB/T 27921-2023 风险管理 风险评估技术GB/T 27921-20112023-08-0659GB/T 27914-2023 风险管理 法律风险管理指南GB/T 27914-20112023-08-0660GB/T 7139-2023 塑料 氯乙烯均聚物和共聚物 氯含量的测定GB/T 7139-20022024-03-01
    时间： 2023-08-10
    作者： dahua1981
  • 对照品如何保存，又应该如何使用？
    对照品系指用于鉴别、检查、含量测定的标准物质，包括杂质对照品，不包括色谱用的内标物质。在药品检验工作中我们常会用到一种用来检查药品质量的特殊参照物——药品标准物质(对照品)。它在药品检验中具有十分重要的地位。随着仪器分析的广泛使用，必将越来越多地使用药品标准物质。下面远慕生物就来介绍一下如何对对照品进行保存和使用：　　(1)对照品应按说明书规定的条件妥善保存，一般置干燥阴凉处保存，某些对照品如维生素E等需避光低温保存。要注意对照品的使用期限，过期、变质的对照品不宜再使用。开瓶后建议短期内用完，避免开瓶后长期不用，同时，在重复使用过程中应尽量避免对照品的分解、污染或吸潮。　　(2)使用中检所对照品时，应严格按说明书执行。一般情况下，供鉴别、检查用的对照品不能用于含量测定。红外鉴别用的对照品使用时应注意与样品在晶型上的差异，必要时可采用相同的方法对样品和对照品重结晶。例如氨苄西林钠具有多种不同的晶型，可用丙酮对样品和对照品重结晶后测定，以确保二者晶型和红外光谱图的一致。　　(3)由中国药品生物制品检定所提供的对照品或国际对照品为法定对照品，以法定对照品作对照标化的原料可称为二级对照品或工作对照品。药品生产单位为节约成本，可使用工作对照品进行日常检验，但药品检验所必须使用法定的对照品，出具的检验报告书才具有法律效力。　　(4)除另有规定外，对照品使用时应采用适宜的方法测定其水分的含量，按干燥品(或无水物)进行计算后使用，否则会造成含量测定结果偏高。对热稳定的对照品可直接干燥后使用；对热不稳定的对照品可同时另取一份作干燥失重，扣除水分后使用。此外，对照品若含有结晶水或盐基，使用时应注意其换算。　　远慕生物提供以下服务：　　1.中药提取物的定制研发和生产，中药提取物代加工相关服务。　　2.中药高含量提取物的工业化高效分离及分离纯化生产　　3.天然产物原料药和中间体的生产，定制（包括合成，半合成）
    时间： 2023-04-23
    作者： 上海远慕生物科技有限公司
  • ​抗体-抗原相互作用研究进展：利用焦碳酸二乙酯共价标记-质谱法进行表位定位
    大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，Epitope Mapping with Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling-Mass Spectrometry，该文章的通讯作者是美国马萨诸塞大学的Richard W. Vachet1。基于单克隆抗体 (mAb) 的疗法之所以成功，是因为抗体与其抗原之间的高特异性和亲和力。表位识别涉及确定 mAb 识别的抗原残基，对于了解结合机制和帮助设计未来的治疗方法至关重要。识别抗原中的结合残基和特异性结合所必需的抗原高阶结构 (HOS) 的特征对于理解结合机制至关重要。在研究完整的抗体-抗原复合物时，质谱 (MS) 已成为一种很有前途的表位定位工具；MS仅需要低样本量，不受分子量的限制，并且比核磁共振或X晶体衍射提供更高的分辨率。目前已经开发了各种用于抗原-抗体相互作用的 MS 工具，其中，共价标记质谱（CL/MS） 已成为一种有前途的补充技术，可以提供残留水平的分辨率并且具有相对较高的通量，通常不会像 HDX-MS 那样遭受标记损失，并且根据试剂的不同，样品制备很简单，不需要专门的设备。焦碳酸二乙酯（DEPC）是一种很有前途的CL试剂，它可以标记许多亲核残基，包括赖氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和 N 端，可以标记平均蛋白质中约 30% 的残基。组氨酸和赖氨酸残基的标记程度与其溶剂可及表面积（SASA）相关，而丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的标记对其微环境敏感，特别是附近疏水残基的存在。此外，DEPC 标记在很大程度上不受毫秒时间尺度上发生的蛋白质动力学的影响。本文为了评估 DEPC-CL/MS 用于研究抗体-抗原相互作用，选择肿瘤坏死因子-α(TNFα)作为模型系统，研究了三种具有不同的表位并在不同程度上稳定TNFα的mAb——阿达木单抗、英夫利昔单抗和戈利木单抗结合TNFα的相互作用。至于具体试剂制备、DEPC-蛋白质反应、蛋白质消化条件、LC-MS 和 MS/MS 参数以及数据分析等详细信息请点击“阅读原文”进一步了解。1、抗体-抗原复合物的 DEPC-CL/MS考虑因素TNFα 是一种含有157个残基的蛋白质，具有35个DEPC可修饰残基。单独标记TNFα 表明其中34个残基可以被修饰，从而提供足够的结构覆盖信息。DEPC-CL/MS 实验通常比较游离蛋白与复合蛋白的标记，以确定结合位点。然而，对于抗体-抗原系统，直接比较游离TNFα与TNFα/mAb复合物较困难，因为抗体增加了过多的可标记残基数量，所以需要含有非结合mAb利妥昔单抗的溶液中的 TNFα 进行对照，从而提供了一种校正由抗体存在而引起的任何标记变化的方法。该对照试验表明，在利妥昔单抗存在时，TNFα中标记的残基较少（34），这表明当存在额外的蛋白质时，某些残基的标记水平降至检测限以下。用利妥昔单抗（即对照）结合TNFα与用另外三种mAb结合TNFα的比较揭示了标记残基的可能发生的三种不同变化（图1）。第一种，有些残留物的标记程度没有显着变化，表明它们的微环境或 DEPC 可及性没有变化。第二种，由于溶剂可及性的增加，引起特别是组氨酸和赖氨酸残基标记的增加；或微环境的变化，引起特别是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基标记的增加（由于DEPC局部浓度增加，可接近的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基周围的疏⽔性更强的微环境导致这些弱亲核残基反应性更⼴泛）。第三种，由于溶剂暴露的损失或疏⽔性更低的微环境，引起残基标记减少。图1. TNFα与mAb复合后标记程度可能的变化情况。TNFα三聚体以灰色表示；抗体以黄色表示；标记用绿色星号表示，星号的大小与标记程度成正比。分别显示了(A)标记程度没有变化、(B)标记程度增加和(C)标记程度减小的结果。2、与阿达⽊单抗复合的TNFα的DEPC-CL/MS阿达⽊单抗在所研究的mAb中具有最⼤的表位，该表位由TNFα同源三聚体的两个亚基组成（图2A、B）。该表位包含11个可修饰残基，其中8个在对照或存在阿达⽊单抗的情况下被标记。其余三个，His78、His73和Lys65，在利妥昔单抗或阿达⽊单抗条件下均未标记，因为它们埋在TNFα三聚体中。图2. 与阿达木单抗复合的TNFα的结构和DEPC标记结果。(A) 阿达木单抗与TNFα三聚体的复合物，阿达木单抗在三聚体凹槽中与TNFα三聚体的两个单体结合。(B)与TNFα 三聚体复合的阿达木单抗Fab的表面结构表示(PDB ID: 3WD5）。(C)使用和不使用阿达木单抗的TNFα中表位残基的DEPC标记程度。(D)使用和不使用阿达木单抗的TNFα中非表位残基的DEPC标记程度。(E)在阿达木单抗结合后标记减少（蓝色）的表位残基映射到TNFα 三聚体上。阿达木单抗以黄色显示，TNFα三聚体以灰色显示。(F)与阿达木单抗结合后标记增加（红色）的表位残基映射到TNFα三聚体上。在比较利妥昔单抗对照和阿达木单抗时，八个表位残基的标记程度发生了变化（图2C）。八个残基中有五个标记减少，包括Tyr141、Lys112、Lys90、Thr72和Ser71，因为在阿达木单抗结合后被埋藏（图2 E）；其中大多数这些残基的标记是完全被阻止的。剩余三个表位残基（Thr77、Ser81和Ser147）在阿达木单抗结合时被标记，但在对照中它们没有被标记（图2F）。Thr77标记的增加可能是由于阿达木单抗重链上靠近Trp53的疏水性微环境增加所致（图3A）。虽然 Ser81 不与阿达木单抗接触，但它被认为是表位的一部分，因为它靠近与mAb结合的Lys90和Glu135（图3B）。Ser147也被标记，可能是由于结合时更加疏水的环境（图3C）。总体而言，TNFα 表位中所有可修饰残基都会发生 DEPC 标记变化，但表位边缘的Thr和Ser残基实际上会增加标记，这些违反直觉的变化反映了 DEPC 标记对这些弱亲核残基的疏水微环境的独特敏感性。图3.阿达木单抗结合时TNFα残基的代表性结构变化。（A）Thr77的微环境由于其靠近阿达木单抗中的Trp53而增加疏水性。（B）Ser81被表位残基Lys90和Glu135掩埋，但在阿达木单抗结合时部分暴露，导致其DEPC反应性增加。（C）在未结合的TNFα中，Ser147完全暴露于溶剂中，然而在阿达木单抗的存在下，Ser147位于更疏水的微环境中。（D）Ser86的微环境在结合状态（灰色）下变得不那么疏水，因为它与Tyr87的接近度降低。（E）Thr89和Thr105由于靠近阿达木单抗而增加标记。（F）Ser9、Tyr151、Tyr119、Tyr56 和 Ser99 的标记范围都有所增加，这些残基十分靠近三聚体界面。在表位之外，标记了21个残基，其中大部分 (11/21) 的标记程度没有变化，表明它们在SASA或微环境中没有发生显着变化。残基Ser86标记程度降低（图2D），是因为其在阿达木单抗结合后重新定位，周围的疏水口袋很可能发生变化（图3D），导致标记减少。表位外的九个残基增加了标记程度。这些残基中的大多数 (7/9) 是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸，其 DEPC 反应性对微环境变化非常敏感。其余两个残基 Thr89 和 Thr105 在利妥昔单抗对照中未标记，但在阿达木单抗结合后，它们的微环境变得更加疏水，可能是由于它们与表位非常接近，所以它们的标记程度增加（图3E )。Ser9、Tyr56、Tyr119 和 Tyr151 的标记增加可能是因为它们面向 TNFα 中的三聚体界面（图3F），在阿达木单抗结合时发生的三聚体的稳定化可能会改变这些残基的微环境，从而增加它们的标记程度。其中两个残基Tyr56、Tyr151在利妥昔单抗对照中完全未标记，并在复合物中被标记，使其行为类似于表位边缘的Ser和Thr残基。标记程度增加的另外两个非表位残基是His15和Lys128，然而，阿达木单抗与TNFα三聚体的Fab的晶体结构并未表明His15或Lys128的SASA变大；阿达木单抗/TNFα 在实验浓度下形成的大于3:1的高阶复合物的复杂变化可能可以解释标记的增加。此外，作者还对英夫利昔单抗复合物中TNFα和与戈利木单抗复合的TNFα进行了DEPC-CL/MS分析。综上所述，本实验使用结合TNFα的三种治疗性mAb，证明 DEPC-CL/MS 可以揭示有关表位的准确信息以及远离表位的细微结构变化。为了获得可靠的结果，需要涉及非结合mAb的对照实验来解释由mAb中存在大量可修饰残基引起的额外标记变化。研究结果表明，表位中的组氨酸和赖氨酸残基在标记中显着减少，而在表位内或表位边缘的弱亲核性丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基由于附近疏水微环境的产生而发生标记程度的增加。大多数远离表位的残基在标记程度上不会发生任何显着变化；确实发生变化的残留物主要分为三类：第一类包括不属于表位但与表位非常接近的残基，因此由于部分掩埋而导致标记程度发生变化；第二类，TNFα三聚体界面上的残基会发生标记变化，这些变化反映了抗体结合后三聚体稳定化引起的结构变化；第三类主要包括弱亲核性残基由于抗体结合时发生的 HOS 变化而在微环境中发生标记增加或减少，并反映在这些残基周围产生或多或少的疏水环境，这是 结构变化或形成具有大mAb/TNFα化学计量的复合物的结果。总而言之，DEPC 标记可以提供有关抗体-抗原表位的信息，并且具有很好的表位定位潜力，也可用于快速筛选潜在的治疗性抗体或生物等效性研究。参考文献：1、Tremblay CY, Kirsch ZJ, Vachet RW. Epitope Mapping with Diethylpyrocarbonate Covalent Labeling-Mass Spectrometry. Anal Chem. 2022 Jan 18 94(2):1052-1059.阅读原文：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c04038
    时间： 2022-04-22
    作者： ONE
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