棕榈酸对照品

如果我们不幸罹患上了癌症，除了积极治疗之外，医生更多地是建议我们要清淡饮食，忌大油大肉，做到均衡营养，从生活习惯上延缓癌症的转移或者复发。这一观点的流行也得益于大家知道癌症是由多因素导致的，不仅包括基因突变还包括环境，甚至是不良的生活习惯。科学研究也支持这一观点，比如高脂饮食（详见BioArt报道：Cell Stem Cell | 高脂饮食促进肿瘤发生的新机制——抑制肠道干细胞MHCII表达）、肥胖（详见BioArt报道：Cell Meta | 肥胖驱动乳腺癌发生发展的机制）等就是癌症的高危因素。这之中，脂肪酸与其转运蛋白CD36就与癌症的发生、发展和药物抵抗有关（详见BioArt报道：Nature | 低糖饮食不仅降糖还抑癌，关键取决于脂代谢）。那么在我们的日常膳食中，哪种脂肪酸与癌症发展有关以及其机制是什么呢？2021年11月10日，西班牙巴塞罗那科学技术研究院的Salvador Aznar Benitah、Gloria Pascual和美国西北大学Ali Shilatifard合作在Nature上发表了文章Dietary palmitic acid promotes a prometastatic memory via Schwann cells，揭示了棕榈酸而不是油酸或者亚油酸可以促进小鼠口腔癌和黑色素瘤的转移。研究人员选择了食用油中常见的棕榈酸（palmitic acid，PA，棕榈油中主要的饱和脂肪酸）、油酸（OA，oleic acid）和亚油酸（LA，linoleic acid）作为研究对象，并利用这三种脂肪酸处理人口腔鳞状细胞癌细胞（OSCC）4天（棕榈酸300uM，在人血液生理浓度内；油酸和亚油酸均为50uM，避免脂毒性），之后再将处理的细胞异种移植到到小鼠身上，发现这三种脂肪酸均不能影响肿瘤的形成，但是只有棕榈酸却能够显著促进肿瘤的转移和转移灶的大小，并且能够诱导脂肪酸转运蛋白CD36的表达。棕榈酸的这种促转移能力是否是因为持续刺激而产生的呢？研究人员就先用不同的脂肪酸刺激口腔癌细胞4天，之后撤除脂肪酸14天，再将其移植到小鼠中，发现经过棕榈酸处理的癌细胞仍然表现出强大的促转移能力，油酸和亚油酸甚至有降低，另外棕榈酸在50uM时也表现出促转移能力。这一结果说明了棕榈酸甚至可以让癌细胞产生“转移记忆”。那么，日常使用棕榈油的效果如何呢？研究人员将OSCC移植到小鼠上，然后分别喂棕榈油、橄榄油和标准饮食10天，之后全部换成标准饮食养至死亡，杀死小鼠后将癌细胞纯化（CD36bright）进行二次移植并进行标准饮食，结果显示只有进棕榈油喂食的小鼠其癌细胞仍然具有强大的转移能力，不仅口腔癌细胞如此，黑色素瘤细胞亦是如此。如果敲除CD36或者中和CD36则会抑制肿瘤转移。细胞记忆与表观遗传有很大的关系。那么棕榈酸导致的肿瘤转移记忆是否也跟表观遗传有关系呢？研究人员在体外使用棕榈酸或油酸处理口腔癌细胞4天，之后撤除棕榈酸培养14天，进行ChIP-Seq（包括H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac、H3K27me3、H3K9me3）。尽管H3K4me1, H3K27me3和H3K27ac的分布在棕榈酸处理4天后存在改变，但大部分在棕榈酸撤除14天后消退，只有H3K4me3形成了稳定的改变。GO分析显示这些H3K4me3改变的基因与神经发生和神经重塑有关，不仅如此，研究人员使用6-羟基多巴胺可以有效抑制癌细胞的转移。启动子转录因子结合实验揭示EGR2结合区域富集明显，敲除EGR2可以改变H3K4me3分布并能抑制癌细胞在体“转移记忆”。H3K4me3与甲基转移酶MLL/COMPASS家族有关，包括MLL1, MLL2, Set1A和Set1B。接下来便是确定癌细胞这一“转移记忆”具体和哪种甲基转移酶有关。在敲除Set1B后，棕榈酸导致的癌细胞“转移记忆”被抑制。前面讲到棕榈酸引起肿瘤细胞表观遗传改变的基因富集在与神经有关的基因上，那么这一“神经特征”是否会影响到肿瘤基质尤其是其中的神经相关细胞呢？研究人员对基质细胞进行了bulk RNA-seq，发现差异基因富集在与细胞外基质组织、神经生成、神经分布、胶质生成等相关的基因上，节点通路相互作用预测分析揭示与神经映射和施旺细胞（Schwann cell）发育相关的通路有关。于是，研究人员就进行了单细胞转录组分析，发现与肿瘤相关的施旺细胞和淋巴管内皮祖细胞改变最为明显。空间转录组分析也揭示施旺细胞在喂食棕榈油的小鼠癌症灶中浸润明显，使用胆碱酯酶ABC消化施旺细胞特异性的细胞外基质成分则能阻止棕榈酸的促转移能力。总之，该研究不仅揭示棕榈油中的棕榈酸可以促进小鼠口腔癌和黑色素瘤细胞的转移，通过表观遗传导致这些癌细胞形成“转移记忆”，也提示了长期食用棕榈油或是癌症转移的高危因素。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04075-0

药用辅料问题近几年困扰了国内的药物制剂生产企业，辅料质量控制引起了监管机构和生产企业的重视。在药典四部辅料品种里对理化检验的指标有具体要求，岛津和合作伙伴开展了辅料检测相关的研究，这里跟大家分享一个案例：聚山梨酯80中多脂肪酸检测。 聚山梨酯80，又名吐温80，是一种非离子型表面活性剂，系油酸酸山梨坦和环氧乙烷聚合而成的聚氧乙烯20油酸山梨坦。因为聚山梨酯80对亲脂性药物有较好的助溶作用，因此常被用作注射剂及口服液的增溶剂或乳化剂，是一种常用的药物制剂辅料。聚山梨酯80通常为混合物，其分子结构中脂肪酸部分的组成大多不同，以油酸为主要成分，同时还含有其他脂肪酸，如肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸等。近年来,在临床应用中出现了一些安全性问题的报道，如过敏、溶血等不良反应。研究表明，副作用的产生可能跟聚山梨酯80的纯度有关，而测定脂肪酸的组成在一定程度上反映了聚山梨酯80的纯度。 2015版中国药典增加了聚山梨酯80要求，2020版中国药典沿用， “聚山梨酯80”品种下有脂肪酸含量要求：肉豆蔻酸(≤5.0%)、棕榈酸(≤16.0%)、棕榈油酸(≤8.0%)、硬脂酸(≤6.0%)、亚油酸(≤18.0%)、亚麻酸(≤4.0%)，与EP、BP等要求一致。 ?Nexis GC-2030气相色谱仪 参考《中国药典》中碱催化三氟化硼/甲醇衍生化前处理方法，遵照药典规定的气相色谱条件，应用岛津Nexis GC-2030（FID）气相色谱仪建立了聚山梨酯80中脂肪酸组成的测定方法，并对市场上的三个聚山梨酯80产品进行了测定。 混合对照品溶液色谱图 （0.1 mg/mL）（上图按出峰顺序：1、肉豆蔻酸甲酯，2、棕榈酸甲酯，3、棕榈油酸甲酯，4、硬脂酸甲酯，5、油酸甲酯，6、亚油酸甲酯，7、亚麻酸甲酯） 按照中国药典前处理方法，在选定的分析条件下，测定三个聚山梨酯80样品中的脂肪酸组成，结果如表5所示。油酸含量越高，表明聚山梨酯80的纯度越高。这三个产品中油酸含量从40%-77%不等，而药典要求油酸含量不低于58.0%，产品C不满足药典要求。 三个聚山梨酯80产品的脂肪酸组成测定结果结论 聚山梨酯80中油酸的含量与其纯度直接相关，通过气相色谱法对聚山梨酯80中脂肪酸进行检测，实验结果有效地反应其中的脂肪酸组成和含量，可用于药品辅料的质量控制，进而降低临床用药的风险。

一、介绍本程序详细说明了在0.10毫摩尔规模下，使用Liberty系列自动化微波肽合成仪将棕榈酸简单且高效地偶联到N端肽上的方法。 请将此文档与Liberty手册和安全数据表（P/N 601400）一起使用。在操作仪器之前，请阅读并充分理解所有文档。图1. 棕榈酸注意必须采取适当的预防措施，避免接触试剂或试剂蒸汽。应根据用户的危险材料安全程序和试剂制造商的安全数据表，佩戴相应的防护装备。请参考这些指南以正确处理和处置试剂。所有废弃物的处理应符合所有适用的国家、地区的健康与安全法规。图2. 棕榈酸与肽的偶联步骤1：编写微波方法创建“90°C 6分钟偶联”微波方法1. 从“编辑”选项卡中，选择“微波方法”。2. 选择以下筛选条件：“0.10”合成规模和“偶联”。3. 通过点击复制按钮，创建“标准偶联”微波方法的副本。4. 重命名为“90°C 6分钟偶联”。5. 编辑“90°C 6分钟偶联”微波方法以使用以下参数值：6. 输入所有参数值后，选择“保存”。 步骤2：使用编程的微波方法创建循环创建“0.10-双90°C 6分钟偶联（高膨胀）”循环编辑器1. 从“编辑”选项卡中，选择“循环”。2. 选择以下筛选条件：“0.10”合成规模、“氨基酸”和“高膨胀”。3. 通过选中并点击复制按钮，创建“0.10-单偶联（高膨胀）”的副本。重命名为“0.10-双90°C 6分钟偶联（高膨胀）”。4. 编辑“0.10-双90°C 6分钟偶联（高膨胀）”循环，以使用以下循环步骤和参数值：5.输入所有循环步骤和参数后，选择“保存”。 步骤3：将循环应用于Liberty方法1. 从“编辑”选项卡中，选择“Liberty方法”以创建新的Liberty方法。2. 在包含棕榈酸溶液的位置的N端添加一个值（一个字母代码）。3. 编辑Liberty方法，使用以下方法选项：&bull C端：根据树脂连接子的指示&bull 树脂类型：根据需要选择&bull 树脂循环：根据需要选择&bull 最终脱保护循环：0.10-无最终脱保护4. 在氨基酸循环网格中，双击棕榈酸偶联的位置，并从下拉菜单中选择“0.10-90°C 6分钟双偶联”循环。5. 选择“保存”并关闭循环编辑器。6. 将Liberty方法加载到树脂指示器位置。7. 为确保准备足够的试剂溶液，选择“计算器”选项卡，然后选择“用量计算器”。请参阅“步骤4：准备试剂”以了解重要的试剂制备。 步骤4：准备试剂1. 在DMF中制备0.2 M的棕榈酸溶液，并将其转移到干净的干燥离心管中。根据方法指示将其加载到所需位置。注意：如果棕榈酸溶液不易溶解，请进行10分钟的超声波处理。2. 称量所需的树脂并转移到干净的反应容器中。将反应容器固定在衰减器上，然后放入微波腔中。3. 准备任何其他必要的试剂，将其加载到仪器上，并开始Liberty方法。二、案例研究：α-黑色素细胞刺激激素（CH3(CH2)14CONH-SYSMEHFRWGKPV-NH2）的自动化棕榈酰化肽合成使用CEM Liberty Blue自动化微波肽合成仪在0.50克Rink酰胺ProTide LL树脂（0.20毫当量/克替代度）上以0.1毫摩尔规模制备了棕榈酰化的α-黑色素细胞刺激激素CH3(CH2)14CONH-SYSMEHFRWGKPV-NH2（图3）。脱保护步骤采用20%哌啶的DMF溶液。偶联反应使用5倍过量的Fmoc-AA-OH和棕榈酸，以及1.0 M DIC的DMF溶液和1.0 M Oxyma Pure的DMF溶液进行。切割使用CEM Razor高通量肽切割系统进行，切割溶液为92.5:2.5:2.5:2.5 TFA/H2O/TIS/DODT。切割后，将肽在Et2O中沉淀并冷冻干燥过夜。图3. 棕榈酰化的α-黑色素细胞刺激激素 分析该肽在配备了Acquity UPLC BEH C8柱（1.7 μm，2.1 x 100 mm）的Thermo Scientific Vanquish UPLC系统上进行分析，并使用PDA检测器。UPLC系统连接至Thermo Exactive Plus Orbitrap，用于结构测定。峰分析通过Thermo Chromeleon软件完成。分离采用梯度洗脱方法，使用0.1% TFA在（i）水中和（ii）乙腈中进行。 结果与结论使用Liberty Blue自动化微波肽合成仪进行CH3(CH2)14CONH-SYSMEHFRWGKPV-NH2（分子量 = 1861）的微波增强固相肽合成（SPPS），目标肽的纯度为75%（见图4和图5）。总合成时间为1小时41分钟，共产生300毫升废物。图4. CH3(CH2)14CONH-SYSMEHFRWGKPV-NH2的UPLC色谱图图5. CH3(CH2)14CONH-SYSMEHFRWGKPV-NH2在保留时间5.13分钟时的质谱图