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各位色友: 你们好! 请问,你们有用watersHPLC,C18柱检测过茶中的洛伐他汀/?
近期,国内仿制药物的一致性评价工作开展的如火如荼,辛伐他汀作为重要品种也受到十分关注。2016年5月26日,国家食品药品监督管理总局发布关于落实《国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见》有关事项的公告,明确规定2018年底前须完成仿制药一致性评价品种目录,共计289个化合物,其中辛伐他汀位于第91个。 辛伐他汀是洛伐他汀的甲基化衍生物,由美国默克公司研制并于1988年首次上市,是目前全球应用最广泛的5个他汀类药物之一。国内生产各种剂量剂型的辛伐他汀片、胶囊的药企约有178家,是口服降血脂药物的重要品种。 生物等效性试验的分析检测方法通常是利用三重四极杆质谱仪([url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS)来测定血浆中的药物浓度来进行的。[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS的定性定量能力都非常好,同时为了满足生物等效性试验中样品分析的快速性,通常希望下能够进行准确定量的前提下,分析方法时间越短越好。 Kromasil采用3.5μm颗粒大小的色谱填料的短色谱柱2.1*50mm,开发了血浆中辛伐他汀的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]/MS的快速检测方法,在3.5min内能够完成一个样品的检测,并能与洛伐他汀完全分离,非常适合于BE研究方案中样品的检测。[b]相关图在附件~[/b]
1.从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法。2.可能模板有问题,模板浓度过小,适当加大模板量。3.Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度。4.将上下引物混合后,在100℃的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的。理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100℃的沸水中煮5分钟可使引物变为单链,以减少二聚体。不过有人认为在PCR仪上95度变性5min也同样达到目的,而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性。6.PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加Taq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些Taq酶会将多余的引物合成为二聚体。7.增加循环数。8.降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加Mg2+浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些)。9.若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。10.以上次的PCR产物作模板二次PCR,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍。