小鼠垂体瘤细胞

垂体是最重要最复杂的内分泌腺体之一，主要由五种激素细胞组成，包括生长激素细胞、催乳素细胞、促甲状腺素细胞、促肾上腺皮质激素细胞和促性腺激素细胞，在生长发育、代谢调节、生殖以及应激等生理过程中发挥重要作用。每种激素细胞都有可能异常增殖形成肿瘤，即垂体神经内分泌肿瘤(Pituitary neuroendocrine tumors，PitNETs)，又称垂体腺瘤或垂体瘤，是第二大常见的颅内肿瘤，大约占颅内肿瘤的10%~16%。基因组学研究发现40~60%的生长激素瘤有GNAS基因突变，40~60%促肾上腺皮质激素瘤有USP8突变，但60%垂体瘤未发现基因突变，病因不明。垂体瘤细胞中哪些基因的表达水平发生了异常变化？传统转录组学未能有效解决这个问题。这是由于正常垂体组织中，五种类型的激素细胞互相混杂，传统的群体细胞转录组学所检测到的实际是“平均激素细胞”。由于缺乏正常对照信息，群体细胞转录组学难以准确鉴定垂体瘤细胞中发生的基因表达变化。另外，多激素垂体瘤和侵袭性垂体瘤是否存在瘤内细胞异质性，也是尚未研究清楚的问题。北京大学生物医学前沿创新中心汤富酬教授和文路副研究员，与北京天坛医院神经外科周大彪主任合作，于2021年4月28日在Neuro-Oncology杂志在线发表题为《 Single-cell transcriptome and genome analyses of pituitary neuroendocrine tumors》的研究论文。该研究对21个病人的23例垂体瘤组织样本进行了单细胞转录组测序（2679个细胞），并对其中5例组织进行了单细胞多组学测序（238个细胞），为深入理解上述问题提供了新的视角（图1）。该研究论文的主要发现包括：图1 垂体瘤病人临床信息1）通过单细胞转录组的无监督式聚类可区分所有垂体瘤亚型，与临床基于免疫组织化学的分类结果一致（图2）。单细胞转录组测序还提供了一些新的有趣信息。例如，一例垂体瘤（P11）同时表达促肾上腺皮质激素细胞关键转录因子T-PIT（TBX19）与促性腺激素细胞关键转录因子SF-1（NR5A1），其细胞在线性降维空间中位于两个谱系之间，显示其处于一种中间状态。另一例垂体瘤（P14）被临床诊断为零细胞垂体瘤，与促性腺激素瘤聚类，提示其细胞来源可能是促性腺激素细胞。图2 所有肿瘤细胞及重要转录因子的表达在PCA图中的映射2）我们分离鉴定出了三种正常垂体内分泌细胞：生长激素细胞、催乳素细胞和促性腺激素细胞，首次获得这些成体垂体激素细胞类型的单细胞转录组图谱。与相应肿瘤细胞类型比较，我们全面鉴定了生长激素垂体瘤、促性腺激素垂体瘤和催乳素垂体瘤的肿瘤差异表达基因谱（图3A-3D）。生长激素瘤的差异表达基因以上调为主（76.1%, 283/372），而促性腺激素瘤的以下调为主（84.3%, 542/643）。生长激素瘤上调的基因中富集分泌相关基因如SCG3，可能与该肿瘤类型的功能亢进特征有关。促性腺激素瘤下调基因中包括LHB和GNRHR等激素相关基因，与该肿瘤类型往往功能沉默有关；下调基因中还富集细胞周期负向调控基因如CDKN2A，表明该肿瘤类型发生了细胞增殖失调。值得指出，研究鉴定出了新的垂体瘤相关基因，如AMIGO2，在生长激素瘤与促性腺激素瘤中表达显著增高（图3E)。图3 A-D，垂体瘤肿瘤细胞和相对应的正常细胞的差异表达基因（A-C）和GO分析（D）。E，垂体瘤肿瘤相关基因在所有细胞中的表达水平3）通过单细胞转录组分析，证实多激素垂体瘤中，多种激素相关基因及转录因子在单个细胞中共表达，未发现瘤内异质性（图4）。在侵袭性瘤中，也未发现明显的瘤内异质性。图4 PIT-1谱系垂体瘤和多激素垂体瘤中单细胞水平的激素相关基因表达4）单细胞多组学分析表明，即使是基因组拷贝数紊乱的垂体瘤，单细胞层次也具有基本一致的拷贝数变异模式，表明其为单克隆起源（图5A）。但我们也鉴定到了少量的瘤内基因组拷贝数变异异质性（图5B）。图5 P20（A）和P21（B）垂体瘤患者肿瘤细胞中的基因组拷贝数变异（CNV）情况总之，本研究首次从单细胞水平上对垂体瘤转录组和基因组进行了较全面分析，解析了瘤间与瘤内异质性，鉴定了新的垂体瘤相关基因，为阐释垂体瘤发病机理与发现治疗靶点提供了新的线索。北京大学生物医学前沿创新中心崔月利博士、博士生蒋振寰、博士后张书博士和北京天坛医院博士生李超为本文共同第一作者。北京大学未来基因诊断高精尖创新中心、生物医学前沿创新中心、生命科学学院汤富酬教授和文路副研究员，与北京天坛医院神经外科周大彪主任为该论文的共同通讯作者。该研究项目得到了国家自然科学基金委和北京大学未来基因诊断高精尖创新中心的支持。论文链接：https://academic.oup.com/neuro-oncology/advance-article/doi/10.1093/neuonc/noab102/6256973

进击的流式细胞术，浅谈百花齐放的FCM新技术与应用2021年08月26日，为期3天的第三届流式细胞技术网络大会（iCFCM 2021）圆满结束。本届大会由仪器信息网主办，开创性设置海外澳洲分会场，首次由中国分析测试协会标记免疫学会分会指导，开设临床应用分会场。本届网络会议吸引来自海内外高校科研单位、生物技术企业、科学仪器技术企业在内百余家单位，远超2000人参加。流式细胞技术(Flow Cytometry, FCM)是一种可以快速、准确、客观地同时检测单个微粒(通常是细胞)的多项特性，并加以定量的技术，具有速度快、精度高、准确性好等优点。流式细胞分析仪正是采用这一技术，普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，同时也可以应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。流式细胞仪作为最重要的细胞研究工具之一，在生命科学基础研究、临床诊断等领域有重要应用。随着诊断、制药等应用级市场对流式技术的需求日益增加，流式技术得到极大普及。近年来处于上游的研发制造创新活力高涨，随着光谱流式、质谱流式等新技术的推广，对流式的应用越来越深入、多元，应用场景还在不断丰富和扩大。本届大会上有哪些新的创新技术和应用领域呢？就技术发展而言，质谱流式和光谱流式都扮演着重要的角色。技术发展篇质谱流式技术质谱流式是近年来发展起来的细胞表征新技术，相比于传统流式细胞术，质谱流式对细胞的分类更精准，不仅可发现以往被忽略的但可能在疾病发生发展中扮演重要角色的细胞亚群，还可以细胞亚群间组合的方式提供全新的观测指标。恶性肿瘤伴随着可逆的全身系统性免疫改变，运用质谱流式技术可能为恶性肿瘤等疾病的早筛早诊提供新的可能。质谱流式技术将荧光染料替换为金属标记，能够获得单个细胞的多种参数，并且克服了传统流式荧光发射基团光谱重叠的问题。质谱流式检测通道理论上可高达百余个，可以同步对更多的细胞特征进行分析。与荧光流式相比，质谱流式技术能够同时检测更多目标蛋白，打破了荧光配色的局限，避免了复杂的补偿操作。更重要的是，从2009年质谱流式正式推出以来，质谱流式（mass cytometry）在肿瘤、免疫、干细胞、代谢等研究领域的影响不断扩大。在这场肆虐全球的新冠疫情中，质谱流式在通道数量、标签稳定性等方面的优势，也使其成为研究病毒感染机制的重要手段。在应用不断扩展的同时，质谱流式技术本身也在不断迭代发展。本届大会中，清华大学张四纯教授、浙江大学盛剑鹏研究员以及浙江大学医学院附属第一医院章琦副主任医师均在质谱流式技术的应用方面深入研究，主要涉及单细胞分析以及肿瘤早期诊断应用。质谱流式典型的技术企业有：富鲁达（Fluidigm）、上海宸安生物光谱流式随着免疫学和诊断医学领域的研究不断深入，如今的流式实验仍然聚焦于同时检测更多颜色，很多研究已经对30色乃至40色以上的多色方案提出了需求。光谱流式细胞术是一种基于常规流式细胞术的技术，其中光谱仪和多通道检测器（通常为CCD）代替了常规系统中的传统反射镜，滤光器和光电倍增管（PMT）。流式细胞仪可以快速进行多参数收集并分析单个细胞或颗粒上的数据。将多色的光谱分析与强大的分选功能相结合，可以更好地帮助科学家开展单细胞层面的基因组学及功能研究。此外，辅以智能化的操作模块，可节省大量的仪器准备时间，并实现高速、高纯度、高活性的细胞分选。可以说，光谱流式代表了近几年新的仪器端技术发展趋势，大幅度增加了流式检测光学信息含量，由简单的信号强度分析扩展到光谱特征分析。该技术能够有效降低试剂选择、试验方案、荧光补偿等复杂度问题，代表了流式技术进入了一个新时代。2011年，索尼获得了普渡大学（Purdue University）的光谱技术专利许可，并致力于开发光谱流式细胞仪。目前典型的光谱流式技术企业有：SONY、Cytek、还有年初收购Bigfoot的赛默飞。流式细胞分选技术流式细胞分选技术是将研究者感兴趣的目标细胞在流式分析鉴定的基础上，重新回收用于后续研究的精确的细胞分选技术，在生物学与医学领域的诸多研究方向如免疫学、肿瘤学、细胞生物学、神经生物学和病原微生物学等中均有重要应用，是现代生命科学、生物医药等广泛的研究领域中不可或缺的实验技术。实现最优良的分选实验，需要在包括仪器、样本、分选操作等大量细节的优化，并且依赖于对分选原理的理解。因此，详细掌握样品制备、仪器准备、上样控制、圈门分选等各个环节的优化操作对于流式分选至关重要。典型的流式分选技术企业：BD、Bio-Rad、Cytek、美天旎等应用领域篇就应用领域而言，流式细胞术已成为分子生物学、医学、免疫学、病理学、植物生物学、海洋生物学等多个研究领域对荧光信号进行高速、灵敏分析的有效方法。肿瘤免疫&临床应用 流式细胞术在临床转化中的应用意义重大，目前，流式细胞术已实现了单细胞分选及测序技术。随着该技术了解的愈发深入，流式细胞术相关的研究论文发表数量逐年增多。据不完全统计，目前借助流式细胞技术平台或相关主题，每年发表的科研论文数量超30万篇。免疫疗法由于其特异性靶向且高治愈率的优势特点，正在不断革新癌症治疗的临床方案和疗效，且愈来愈要求个性化精准治疗。从基础医学到临床诊断，稀有细胞得到越来越多的关注，如循环肿瘤细胞（CTCs），抗原特异性T细胞外泌体等数量稀少，但对恶性肿瘤进行早期诊断、预后评估，以及获得肿瘤耐药性评估等重要信息。流式细胞术除在临床转化中的应用外，在血液病诊疗中的应用也十分广泛。流式细胞技术可应用于血液系统恶性疾病免疫表型及MRD的判断，借助免疫表型判断白血病的不同疾病时期。流式细胞术不仅可用于CAR-T治疗患者的监测，同时在各种良、恶性疾病的诊断、治疗，感染的免疫指标评价，移植物抗宿主病、CMV、EBV或者其他感染等移植后并发症的诊断、评价，噬血综合征等特殊免疫状态的监测与防治中，都起到极为重要的作用。自身免疫病中自身抗体非常复杂，一种自身免疫病可能有多种自身抗体，一种自身抗体也可能见于多种自身免疫病。多种自身抗体的联合检测，对疾病的辅助诊断、鉴别诊断、疗效监测、预后评估等具有重要的价值。近年来，随着技术的进步，越来越多自身免疫病特异性或相关性自身抗体在临床得到推广使用，临床也对实验室自身抗体检测菜单、检测效率、能否给出定量结果等提出更高的需求。流式荧光技术因其可多项联检、高效、定量等优势，能很好地助力自身抗体检测，助力疾病诊疗，技术进步，恰逢其时。此外，流式荧光技术在HPV、细胞因子、肿瘤标志物以及Torch检测领域均表现出重要的应用。北京大学第一医院闫存玲主任、中国医学科学院肿瘤医院陈汶教授、青岛市海慈医疗集团（青岛市中医医院）宗金宝主任、上海市华东医院赵虎主任、浙江省儿童医院尚世强主任等重磅专家为大家呈现精彩的报告分享。（敬请观看流式大会的精彩报告视频回放https://www.instrument.com.cn/webinar/video/collection/10897）。外囊泡/纳微医药应用纳微米颗粒、外泌体以及近红外材料在生物示踪以及生物医药领域的研究越来越受关注。其中细胞外囊泡是肿瘤液体活检的重要生物标志物。由于纳米尺寸的细胞外囊泡超出了流式细胞术的检测限，通过将囊泡吸附在微球上并借助抗体的特异性识别，实现了对细胞外囊泡表面特定蛋白分子信息的放大，从而可通过流式细胞术对细胞外囊泡的检测和分析。实现了乳腺癌、脑胶质瘤、垂体瘤等的肿瘤进展评估、预后评价等临床应用。流式作为一种重要定量手段，有助于最大程度实现对特定类微纳米颗粒的精准设计，可应用于药物载体和疫苗佐剂研究。基于流式技术，可以开展颗粒/细胞表征、有效性/安全性评价工作，为该领域相关研究提供参考。重要的是，成像流式作为独特的流式技术，因其超高灵敏度和可视化的流式数据，突破了长期以来存在于外泌体、纳米材料等微颗粒检测中的瓶颈。通过提供明场和多通道的荧光图像，清晰分辨每个微颗粒的表征，溯源其与亲源细胞间的关系，以及与靶向细胞间的相互作用，在微颗粒研究、体外诊断、药物开发等领域有着独特的、不可或缺的应用。动、植物/微生物检测应用围绕水环境保护、渔业可持续发展、微藻生物能源方面的重大战略需求，流式细胞技术在鱼类遗传育种学、藻类生物学、淡水生态学、水环境工程学和保护生物学的应用具有一定的优势。流式技术在除人、小鼠以外其他多种模式生物中具备组织特异性的流式检测及分选应用也十分广泛。病毒是颗粒很小、以纳米为测量单位的非细胞型微生物。它在疾病预防、传染病爆发等方面扮演重要角色。对病毒生物学、病毒与宿主相互作用、免疫应答机制等研究，有利于药物与疫苗的研发，建立快速有效的临床诊断和治疗体系。流式细胞术在病毒颗粒检测、疫苗效价评估、免疫细胞亚群及免疫反应分析等流程中是必不可少的方法之一。此外，仪器的质控是流式课题必须和不可或缺的步骤。流式仪每天都需要通过质控以确保数据的准确性。熟悉日常流式仪器质控的主要参数，掌握如何进行和解读质控，仪器性能跟踪和故障排除。长期流式课题的实验间质控的必须性和方法，并且掌握如何通过质控获得可重复性的结果都非常重要。

小鼠原代海马神经元细胞的分离培养方法！海马体主要负责记忆和学习，日常生活中的短期记忆都储存在海马体中。神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元具有长突起，由细胞体和细胞突起构成。小鼠海马神经元细胞的组织来源于实验小鼠的正常脑组织，因为海马神经元细胞类似于干细胞属于高分度分化的细胞特性，具有不能传代，不能增殖等特点，所有收到细胞后尽快使用。为了更好的服务于广大科研工作者，百欧博伟生物技术人员特提供了海马神经元细胞分离培养方法，技术因人而异仅供参考：1、试验所需仪器设备及试剂（1）仪器生物安全柜CO2细胞培养箱荧光倒置显微镜高速冷冻离心机电热恒温鼓风干燥箱（2）试剂耗材T25细胞培养瓶血球计数板细胞培养孔板红细胞裂解液神经元完全培养基0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）多聚甲醛（PFA）DAPITriton X-100山羊血清NSEGoat anti-Rabbit lgG（H+L）Cross-Adsorbed Secondary antibody，Alexa Fluor 594Fluoromount-G荧光封片剂2、分离培养方法1) 取1-10 d的新生小鼠。用75%的乙醇浸泡，2) 在冰浴的PBS中分离海马，PBS洗涤3次，剪碎，3) 用0.25% Trypsin + 0.1% Ⅰ型胶原酶37℃水浴振荡消化30min，4) 用FBS终止消化，轻轻吹打，5) 过100 μm 滤网，6) 收集滤液，300 g离心5 min，7) 用完全培养基重悬沉淀，铺瓶。3、免疫荧光3.1.实验步骤（1）细胞爬片取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜。（2）固定细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4% PFA于4℃固定30min。用PBS洗3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜。（3）破膜封闭将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，玻璃片封闭液配置：0.5% Trition X-100与PBS 1:1混合，再加10% 血清，取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。（4）一抗孵育一抗配制：抗体与PBS 1:100（200）稀释破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上（湿盒中），将玻片（有细胞的一面）盖上置于4℃（最多可放置一周）（5）二抗孵育室温避光孵育二抗（二抗:PBS=1:500）2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI（DAPI:PBS=1:1000）5min，PBS洗3×5min/次。（6）包埋玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。鉴定细胞为P1代细胞3.2.检测结果（1）细胞免疫荧光鉴定照片阴性100X-DAPINSE100X-DAPI（2）检验基本情况：经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达到90%以上。除了上述的细胞分离方法以外，百欧博伟还有很多关于其他细胞的分离方法，想要学习的小伙伴可以来百欧博伟进行现场学习，如果想要其他原代分离培养方法，可打电话或咨询相关技术人员哦。