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益母草具有祛瘀生新,调经活血,素有“经产良药”之称。益母草主要有效成益母草碱、盐酸水苏碱等,益母草中盐酸水苏碱的含量测定方法较多,主要有分光光度法[1],高效液相色谱法[2,3],薄层扫描法[4]等。《中国药典》2000年版 一部[1]益母草项下对益母草规定了总生物碱的含量,采用的测定方法是分光光度法,但该方法的重现性不好。笔者曾参考文献资料报道[2,3],采用高效液相色谱法试验,文献记载中所用的条件也均未能有较好的重现性,《中国药典》 2005年版 一部[1]益母草项下的含量测定方法采用了双波长薄层色谱扫描法,但其展开剂为乙酸乙酯-正丁醇-盐酸(1:8:3),展开速度极慢,本试验对所用展开剂及显色剂、显色方法加以改进,取得满意结果,现报告如下。 1 仪器、药品与试剂 CS-930型双波长薄层扫描仪,日本岛津公司生产;硅胶G薄层预制板,青岛海洋化工厂分厂生产;盐酸水苏碱对照品(含量测定用,批号:110712-200306),购自中国药品生物制品检定所;所用试剂均为分析纯;益母草(Leonurus japonicus Houtt.)药材购自山西太原万民大药房(经山西中医学院中药鉴定教研室鉴定)。 2 方法与结果 2.1 供试品溶液的制备 取益母草0.5g,精密称定,置具塞三角瓶中,精密加入乙醇50ml,称定重量,超声处理30min,放冷,再称定重量,用乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,置蒸发皿中,于水浴上蒸干,用盐酸-甲醇(1:100)溶解并转移至5ml量瓶内,加盐酸-甲醇(1:100)至刻度,摇匀,作为供试品溶液。 2.2 对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥至恒重的盐酸水苏碱对照品20mg至20ml量瓶中,加盐酸-甲醇(1:100)溶液使溶解,并稀释至刻度,摇匀,即得(每1ml中含盐酸水苏碱1mg),作为对照品溶液。再分别取1ml,2.5ml,5 ml,7.5ml用盐酸-甲醇(1:100)溶液稀释至10ml,即得到0.1mg/ml,0.25mg/ml,0.5 mg/ml,0.75mg/ml的对照品溶液。 2.3 展开、显色及扫描条件选择 分别吸取盐酸水苏碱对照品溶液及供试品溶液,点于同一硅胶G薄层板上,以丙酮-无水乙醇-盐酸(10:10:1)为展开剂,展开,取出,晾干,于100℃加热10min,取出,放冷,喷以稀碘化铋钾-1%三氯化铁乙醇(2:1)试液,冷风吹至斑点显色清晰。进行光谱扫描,最大吸收波长λs=510mm,参比波长λR=700nm,SX=3。 2.4 线性关系的考察 精密吸取不同浓度(0.1mg/ml,0.25mg/ml,0.5mg/ml,0.75mg/ml,1mg/ml)的对照品溶液各5μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以丙酮-无水乙醇-盐酸(10:10:1)为展开剂,展开,取出,晾干,于100℃加热10min,取出,放冷,喷以稀碘化铋钾-1%三氯化铁乙醇(2:1)试液,冷风吹至斑点显色清晰。照薄层色谱法(《中国药典》 2000年版 一部 附录Ⅵ B)进行扫描, 以点样量为横坐标,吸收度积分值为纵坐标作图,得一直线,回归方程:Y=10869X-1973.9,r=0.9991,盐酸水苏碱点样量在1.0~10.0μg范围内呈良好线性。 2.5 精密度试验 2.5.1 异板精密度试验 精密吸取盐酸水苏碱对照品溶液4μl,分别在不同的硅胶G薄层板上点样,展开,晾干,加热,放冷,显色,扫描,测定吸收度积分值RSD%=2.15。 2.5.2 同板精密度试验 分别精密吸取盐酸水苏碱对照品溶液4μl,在同一块硅胶G薄层板上点5点,展开,取出,晾干,加热,放冷,显色,扫描,测定吸收度积分值RSD%=0.82。 2.6 稳定性试验 取供试品溶液在0、0.5、1.5、2.0h分别点样5μl ,测定样品中盐酸水苏碱斑点吸收峰面积积分值,RSD%为2.61。试验结果表明,经显色后斑点在2h内稳定。 2.7 重复性试验 按拟定的含量测定方法,对同一批样品分别制备5份供试品溶液,精密吸取5μl,点样, 测定斑点吸收峰面积积分值并计算含量。益母草中盐酸水苏碱的含量平均为0.10,RSD=1.90 %。 2.8 回收率试验 采用加样回收法试验。精密称取已知含量的益母草约0.25 g, 精密加入盐酸水苏碱对照品溶液(1mg/ml)1ml,按样品测定项下操作,计算回收率。结果盐酸水苏碱的平均回收率为97.24%, RSD%为1.75%(n=5)。 2.9 样品测定 精密吸取对照品溶液2μl、6μl和供试品溶液10μl,交叉点于同一硅胶G薄层板上,按上述条件测定斑点吸收峰面积的积分值,以外标二点法计算含量,结果益母草中盐酸水苏碱的平均含量为0.50%,RSD为2.39%(n =6)。 3 讨论 《中国药典》2000年版一部[1]益母草项下对益母草规定了总生物碱的含量,采用的测定方法是分光光度法,但无法重复。笔者曾对文献记载的高效液相色谱法所用的条件反复试验,均未能有较好的重现性。彭维[5]明确提出所有报道益母草含量测定中所用的高效液相色谱法,没有方法能够重复出来。本试验采用双波长薄层色谱扫描法,并对展开剂、显色剂及显色条件加以改进,结果满意。可为益母草及其制剂的含量测定提供有效的方法。 《中国药典》 2005年版一部[1]益母草含量测定项下展开剂为乙酸乙酯-正丁醇-盐酸(1:8:3),但展开速度缓慢,本实验以丙酮-无水乙醇-盐酸(10:10:1)为展开剂展开,速度快,分离效果好。 取供试品溶液及对照品溶液点样,展开,取出之后,必需加热至展开剂挥尽再显色,斑点在2h内稳定,否则影响显色效果。 【参考文献】 1 国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京:化学工业出版社,2000,一部,237-238;203-204. 2 戚建中. 产妇康颗粒中盐酸水苏碱的HPLC分析.中成药, 2001,23(1):16-18. 3 姜舜尧.益母草药材中水苏碱成分的高效液相色谱法分析.药物分析杂志,2001,(4):21. 4 章曙丹. 薄层扫描法测定鲜母益胶囊中盐酸水苏碱的含量.中成药,2004,26(4):附7. 5 彭维. 产妇康颗粒质量标准研究.中药材,2003,26(3):198-200. (编辑:宋 冰) 作者单位: 030024 山西太原,山西中医学院中药系
10版药典刚加入用蒸发光检测器测益母草药材中盐酸水苏碱含量,小弟不才,死活测不出来,特此求教各位大虾的帮助。第一次测时对照色谱图比较清晰,出峰时间是2min。。。到第二次测时,对照色谱图直接成了锯齿状。此外两次测得的样品图谱都是锯齿状的,什么都看不出来。 我用的蒸发光检测器是varain-380,流动相及样品处理方法是按药典来的。泵流速0.5ml/min,柱温20℃,蒸发温度90℃,雾化温度60℃,气体(氮气)流速1.5。不知道有哪位大虾对这个比较熟悉或是做过益母草含量的,望指点迷津!有用别的检测器测益母草药材中盐酸水苏碱含量的也希望交流学习用,分光光度法就免了 再次小弟先谢谢各位大虾们了!
问题好多,烦请各位老师认真看一下益母草颗粒或益母草膏中盐酸水苏碱含量测定,色谱条件:乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾-磷酸(15:85:0.15)为流动相。色谱柱为Biobasic SCX,Thremofisher公司的。液相色谱仪为赛默飞世尔U3000高效液相色谱仪。柱温30,流速1.0ml/min。检测波长为192nm,在此条件下检测不出色谱峰,后将0.05mol/l的磷酸二氢钾改为0.03mol/l的浓度,结果出峰了,但峰的分离效果不好图1是对照的色谱峰,对照是用甲醇配制的,然后我进了一针甲醇的空白结果如图2可以看出加了对照后,第一个色谱峰变大,后面多了一个峰,不过没分开。为了确认该峰是否为要的峰,我在对照品溶液中又加了一点对照品,结果如图3前后两个峰都变大,郁闷死我了。。。。。。。。。。。期间也调低了流速,调低了柱温,更改了流动相中乙腈的比例,结果都不理想,后来将0.05mol/l的磷酸二氢钾改为0.01mol/l的浓度,对照品的峰可以比较明显的分出来了,如图4但是峰形不好,本想这样将就用着的,后来在这个对照中加入一点对照品后,前后峰的面积又都变大了。峰如下图5这是什么原因呢?是盐酸水苏碱溶解在甲醇中产生了什么反应么?为什么甲醇中也有那个色谱峰呢?之后我决定进样品,益母草颗粒,称一克,用0.5%的盐酸甲醇溶液25ml超声30min,进样后结果如图6问题好多啊,为什么对照峰前拖尾,样品峰后拖尾?还有样品我也尝试了那些方法,都没有使峰很好的分离出来,样品该怎么分离好呢?还得调磷酸二氢钾浓度么?之前看到网上有很多说用乙腈-0.05mol/l磷酸二氢钾-磷酸(15:85:0.15)的流动相做出结果的,为什么我的做不出来,要换成0.01mol/l的呢?[img=,690,417]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131150569283_4003_1791505_3.png!w690x417.jpg[/img][img=,690,422]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131150586305_6177_1791505_3.png!w690x422.jpg[/img][img=,690,426]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131151014335_4399_1791505_3.png!w690x426.jpg[/img][img=,690,428]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131151040285_6173_1791505_3.png!w690x428.jpg[/img][img=,690,420]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131151065795_1809_1791505_3.png!w690x420.jpg[/img][img=,690,413]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/08/201908131151088295_2442_1791505_3.png!w690x413.jpg[/img]