双筒斜管显微镜

James DeRose 博士 Georg Schlaffer徕卡显微系统数码显微系统是显微镜学的流行语之一，此外，还有一些非常有用的常识。徕卡显微系统的产品经理 Georg Schlaffer 常常会被客户和同仁问及有关数码显微系统方面的问题。为了答疑解惑，他与科学作家 Jim DeRose 共同合作，对最重要的几个问题进行了全方位解答。到底什么是数码显微系统？数码显微镜属于带数码相机的光学显微镜，无需配备目镜。电子监控器显示屏会直接显示观察和分析的样品图像。数码显微镜还可以是常规体视或复式显微镜，它们同时配备目镜和相机，能够保存显微镜状态和相机设定值的反馈信息。在本文的接下来部分中，我们提到的“数码显微镜”是指不带目镜的显微镜，例如，Leica DVM6、Leica DMS1000，和 Leica DMS300，而不是配备相机的体视或复式显微镜。左：Leica DVM6 数码显微镜右：镀金焊盘，汽车用电子设备，总放大倍率：120:1。图像由 Leica DVM6 获取。哪些应用领域可以使用数码显微镜？在研发、生产和检测、质量控制和保证，以及失效分析过程中，数码显微镜是分析部件和样品并生成检测报告的理想仪器。左：镀金焊盘，汽车用电子设备，总放大倍率：360:1。图像由 Leica DVM6 获取。右：通过 Leica DVM6 倾斜显示屏予以显示。数码显微镜的优势何在？数码显微镜最显著的优势在于仪器的人机工程学设计。由于监控器会直接显示样品图像，用户可以在保持舒适、放松的直立坐姿的同时，还能即时观察样品，并利用软件分析样品图像，保证用户能以舒适的姿态高效地完成工作。在需要处理高通量样品，或每天需要在显微镜上花费较长时间的情况下，数码显微镜的人机工程学设计就显得意义非凡了。此外，很多数码显微镜还提供允许存储多个用户配置文件的软件。在多人共用一台显微镜时，这项功能非常有用，凭借这项功能，每个用户只需选择自己的显微镜配置文件，几乎无需调节显微镜工作台，即可轻松开始工作。左：纸上印刷图案，总放大倍率：750:1，环形光照明。图像由 Leica DVM6 获取。右：纸上印刷图案，总放大倍率：750:1，起偏镜开启时的同轴照明。图像由 Leica DVM6 获取。数码显微镜有哪些限制条件？相比体视或复式显微镜，数码显微镜存在一个明显的限制条件，即需要电源连接，因为数码显微镜未配备目镜，而样品图像却始终需要显示在监控器上。因此，至少需要一根电源线。通常情况下，数码显微镜还需要连接 PC，或至少需要连接显微镜的显示屏。通过传统的显微镜，用户仍可以选择使用目镜获取样品图像。左：Leica DMS1000 数码显微镜右：金属部件上的一个孔；自动更新每项变焦设置比例，实现快速测量。图像由 Leica DMS1000 获取。通过数码显微镜和目镜分别观察到的样品图像相比，结果如何？原则上，图像是相同的。视场角可能存在差别，这主要取决于我们正在讨论的数码相机和目镜的类型。但是，还有一个重要差别：采用体视显微镜的双筒目镜观察样品，将为您带来数码显微镜的二维图像无法达到的深度。左：表壳，通过环形光照明 (Leica LED3000 RL) 和入射光座捕捉。图像由 Leica DMS1000 获取。右：Leica DMS1000 B 图像：利用透射光座捕捉的秀丽隐杆线虫图像；因不断编码变焦，从而保证快速、简单地测量，即使在不配备电脑的单机模式下亦可实现。数码显微镜操作上比带目镜的显微镜要简单吗？尤其对于无经验的用户而言，利用数码显微镜，他们也能够更简单、更快速地获取样品图像。造成上述差别的主要原因是，熟悉设置和调整传统型显微镜，并透过目镜观察样品，这些操作需要花费较长时间。左：果蝇属筛查。图像由 Leica DMS1000 B 获取。右：利用固定在摇臂机架上的 Leica DMS300 观察印刷电路板样品“编码”的含义是什么？当显微镜硬件可直接与计算机软件进行通信，且能够利用图像数据完成对特定参数值的追踪和保存时，表示显微镜已完成“编码”。这些特定参数将得以被设定，并因此被称之为已编码参数值。正常情况下，触摸相关按钮，即可调用这些已编码参数，令重复工作和报告变得更轻松。必须成为显微系统的专家，才能操作数码显微镜吗？当然不需要。无论是显微系统的新手还是专家，都可以轻松使用数码显微镜。徕卡显微系统提供的数码显微镜，其设计宗旨就是简单易用、开箱即用，最大程度地减少培训时间。它们配备已编码的功能，能够轻松生成分析报告，令重复工作更加高效。数码显微镜需要配备哪些部件？所需配件依据应用领域而定。例如，可以根据所需的放大倍率范围，选择物镜透镜。您还可以在一系列主机和照明系统中进行选择。以下这些问题会帮助您决定需要哪些部件或功能： 是否需要快速获取高质量数字图像？如果需要，您可以选择高分辨率数码相机。 是否需要高通量样品的快速、实时图像显示？如果需要，您可以将相机速度设置为每秒 30 帧或更快。 是否需要从不同角度观察样品？如果需要，倾斜显微镜镜头或转动样品载物台，实现工作过程或物体的动态观测。 是否需要定性或定量分析样品？如果需要，必须认真选择软件功能。 是否需要平衡图像，同时清晰展示明亮和暗色部分？如果需要，您可以选择 HDR（高动态范围）功能，它能够为您精确提供所需的图像类型。了解更多：https://www.leica-microsystems.com/?nlc=20191231-SFDC-008340

人的肉眼分辨本领在0.1毫米左右，我们是怎么一步步地看见细菌、病毒，乃至蛋白质结构的呢？这背后离不开这群“强迫症”。采访专家：张德添（军事医学科学院国家生物医学分析中心教授）“我非常惊奇地看到水中有许多极小的活体微生物，它们如此漂亮而动人，有的如长矛穿水而过，有的像陀螺原地打转，还有的灵巧地徘徊前进，成群结队。你简直可以将它们想象成一群飞行的蚊虫。”1675年，一名荷兰代尔夫特市政厅的小公务员给英国皇家学会写了这样一封信，向学会的会员们描述自己用自制的显微镜观察到的奇妙景象。作为给当时欧洲最富盛名的学术组织寄去的一封学术讨论信件，这名公务员并没有进行大篇幅严谨却枯燥的科学论证，而是用朴实的语言，在字里行间留下了自己发现新事物时那种孩童般的惊奇与喜悦。这位当时默默无闻的小公务员，正是大名鼎鼎的微生物学和显微镜学先驱者—安东尼范列文虎克。在50年的时间里，列文虎克用制作的显微镜观察到了细菌、肌纤维和精细胞等微观生物，并先后给英国皇家学会寄去了300多封信件来讨论他的新发现。正是在列文虎克的不懈坚持下，人类观察世界的眼睛终于来到了微生物层面。初代显微镜：拨开微生物世界的迷雾列文虎克能发现色彩斑斓的微生物世界，主要得益于他在透镜制作方面的天赋。他一生中制作了多达400多台显微镜，与今日我们熟知的显微镜存在很大不同，列文虎克的显微镜绝大多数属于单透镜显微镜，仅由一个小黄铜板构成，使用时需要仰身将这个铜板面向阳光进行观察。列文虎克凭借他的一系列惊人发现迅速成为当时科学界的“网红级”人物。然而真正奠定显微镜学理论基础的，则是同时期的英国科学家罗伯特胡克。在列文虎克还在钻研透镜制作技艺时的1665年，在英国皇家学会负责科学试验的胡克，就制作了一台显微镜，与列文虎克使用的单透镜显微镜不同，这是一台复式显微镜，其工作原理和外形已经很接近现代的光学显微镜了。胡克用这台显微镜观察一片软木薄片，发现了密密麻麻的格子状结构，酷似当时僧侣居住的单人房间，因此胡克就用英语中单人间一词“cell”来命名这种结构，而这个单词在当代被翻译为“细胞”。不久，胡克写就了《显微图谱》一书，将这一重要观察成果写入书中。胡克的研究成果很快引起了列文虎克的注意，他曾研究过胡克的显微镜，但最后还是使用了自制的单透镜显微镜来进行观察。原因就在于胡克显微镜存在严重的色差问题。所谓色差，就是在光线经过透镜时，不同颜色的光因折射率不同，会聚焦于不同的点上，使得样品的成像被一层色彩光斑所包围，严重影响清晰度。列文虎克提出的解决方案也很简单，就是在透镜研磨的精细程度上下功夫，将单透镜制成小玻璃珠，并将之嵌入黄铜板的细孔内，这样在放大倍数不低于胡克显微镜的基础上，最大程度避免色差对成像的干扰。但代价是，由于观察时是需要对着阳光，对观测者的眼睛伤害很大。除了色差，早期显微镜还存在着球面像差问题，即光线在经过透镜折射时，接近中心与靠近边缘的光线不能将影像聚集在一点上，使得成像模糊不清。自显微镜诞生之日起，色差和球面像差就成为“与生俱来的顽疾”，一直制约着人们向微观世界进军的步伐。直到19世纪，光学显微技术才在工业革命的助力下完成了一次实质性蜕变，从而在根本上解决了这两个难题。挑战色差与球面像差：逐渐清晰的微观视角首先是1830年，一个名为李斯特的英国业余显微镜学爱好者首先向球面像差发起挑战，他创造性地用几个特定间距的透镜组，成功减小了球面像差影响。此后，改进显微镜的主阵地很快转移到了德国，其中1846年成立的蔡司光学工厂，更是在此后一个世纪里成为领头羊。1857年蔡司工厂研制出第一台现代复式显微镜，并成功打入市场。不过在研制和生产过程中，蔡司也深受色差之苦：当时通行的增加透镜数量的做法，虽能提升显微镜的放大倍数，却仍无法消除色差对成像清晰度的干扰。1872年，德国耶拿大学的恩斯特阿贝教授提出了完善的显微镜学理论，详细说明了光学显微镜的成像原理、数值孔径等科学问题。蔡司也迅速邀请阿贝教授加盟，并研制出一批划时代的光学部件，其中就包括复消色差透镜，一举消除了色差的影响。在阿贝教授的技术加持下，蔡司工厂的显微镜成为同类产品中的佼佼者，很快成为欧美各大实验室的抢手货，并奠定了现代光学显微镜的基本形态。不久，蔡司又拉来了著名化学家奥托肖特入伙，将其研制的具有全新光学特性的锂玻璃应用在自家产品上。1884年，蔡司更是联合阿贝与肖特，成立了“耶拿玻璃厂”，专为显微镜生产专业透镜。显微镜技术的突飞猛进也让各种现代生物学理论不断完善，透过高分辨率的透镜，微观世界中各种复杂的结构逐步以具象的形式呈现在人类眼前。由于微观层面的生物结构大多是无色透明的，为了让他们在镜头下变得清晰可见，当时的科学家普遍将生物样品染色，以此提高对比度方便观察。这一方法最大的局限在于，染料本身的毒性往往会破坏微生物的组织结构，这一时期染剂落后的材质，也无法实现对某些特定组织的染色。直到1935年荷兰学者泽尼克发现了相衬原理，并将之成功应有于显微镜上。这种相衬显微技术，利用光线穿过透明物体产生的极细微的相位差来成像，使得显微镜能够清晰地观察到无色透明的生物样品。泽尼克本人则凭借此次发现斩获了1953年的诺贝尔物理学奖。军事医学科学院国家生物医学分析中心教授，长期致力于电子显微镜领域研究的张德添向记者介绍道：“人的肉眼分辨本领在0.1毫米左右，而光学显微镜的分辨本领可以达到0.2微米（1毫米=1000微米）的水平，能够看到细菌和细胞。但由于光具有波动性，衍射现象限制了光学显微镜分辨本领的进一步提高。”二战结束后，随着各种新理论新技术的不断应用，光学显微镜得到了长足进步，但也是在这一时期，光学显微镜的潜力已经被发掘到了极限。为蔡司工厂乃至整个显微镜学立下汗马功劳的阿贝教授就提出了“分辨率极限理论”，认为普通光学显微镜的分辨率极限是0.2微米，再小的物体就无能为力了—这一理论又被称为“阿贝极限”，这就好像一层屏障将人类的探索目光阻隔在更深度的微观世界大门之前，迫使科学家们另寻他途。电子显微镜：另辟蹊径，重新发现既然可见光存在这样的短板，那么能否利用其他波长较短的光束来实现分辨率的突破呢？张德添进一步介绍道：“1924年后，人们从物质领域内找到了波长更短的媒质—电子，从而发明了电子显微镜，其分辨本领达到了0.1纳米的水平。”1931年，德国科学家克诺尔和他的学生鲁斯卡在一台高压示波器上加装了一个放电电子源和三个电子透镜，制成了世界首台电子显微镜，就此为人类探索微观世界开拓了一条全新的思路。电子显微镜完全不受阿贝极限的桎梏，在分辨率上要远远超越当时的光学显微镜。鲁斯卡在次年对电子显微镜进行了改进，分辨率一举达到纳米级别（1微米=1000纳米）。在这个观测深度，人类终于亲眼看到了比细菌还要小的微生物—病毒。1938年，鲁斯卡用电子显微镜看到了烟草花叶病毒的真身，而此时距离病毒被证实存在已经过去了40年时间。对于电子显微镜技术的发明，张德添这样评价道：“电子显微镜是人们认识超微观世界的钥匙和工具，它解决了光学显微镜受自然光波长限制的问题，将人们对世界的认识从细胞水平提高到了分子水平。” 从肉眼只能观察到的毫米尺度，到光学显微镜能够达到的微米尺度，再到电子显微镜能进一步下探到纳米尺度，显微成像技术正在迅速突破人类对微观世界的认知极限。不过电子显微镜本身的缺憾也愈加明显。由于电子加速只能在真空条件下实现，在真空环境之下，生物样品往往要经过脱水与干燥，这意味着电子显微镜根本无法观测到活体状态下的生物样品，此外电子束本身又容易破坏样品表面的生物分子结构，这就导致样品本身会丢失很多关键信息。这一顽疾在此后又困扰了科学家多年。直到1981年，IBM苏黎世实验室的两位研究员宾尼希与罗雷尔，用一种当时看起来颇有些“离经叛道”的方法，首先解决了电子束损害样品结构的问题。他们利用量子物理学中的“隧道效应”，制作了一台扫描隧道显微镜。与传统的光学和电子显微镜不同，这种显微镜连镜头都没有。在工作时，用一根探针接近样品，并在两者之间施加电压，当探针距离样品只有纳米级时就会产生隧道效应—电子从这细微的缝隙中穿过，形成微弱的电流，这股电流会随着探针与样品距离的变化而变化，通过测量电流的变化人们就能间接得到样品的大致形状。由于全程没有电子束参与，扫描隧道显微镜从根本上避免了加速电子对生物样品表面的破坏。扫描隧道显微镜在今天也被称为“原子力显微镜”，“在微米甚至纳米水平，动态观察生物样品表面形貌结构的变化规律，原子力显微镜是有其独特优势的”，张德添向记者解释说，“如果条件允许，还可以检测生物大分子间相互作用力的大小，为结构与功能关系研究提供便利。”1986年，宾尼希和罗雷尔凭借扫描隧道显微镜，获得当年的诺贝尔物理学奖，有趣的是，与他们一起分享荣誉的，还有当初发明电子显微镜的鲁斯卡，当时的他已是耄耋老人，而他的恩师克诺尔也早已作古。新老两代电子显微镜技术的里程碑人物同台领奖，成为当时物理学界的一段佳话。老树新芽：突破“阿贝极限”的光学显微镜电子显微镜在问世之后的几十年间，极大拓展了人类对生物、化学、材料和物理等领域认知疆界。而无论是鲁斯卡，还是宾尼希和罗雷尔，他们所作的贡献不仅让自己享誉世界，还助力其他领域的学者登上荣誉之巅。比如英国化学家艾伦克鲁格凭借对核酸与蛋白复杂体系的研究获得1982年度诺贝尔化学奖，而他的科研成果正式依靠高分辨电子显微镜技术和X光衍射分析技术而取得的。在克鲁格获奖的当年，以色列化学家达尼埃尔谢赫特曼更是使用一台电子显微镜，发现了准晶体的存在，并独享了2011年的诺贝尔化学奖。目前，电子显微镜已经成为金属、半导体和超导体领域研究的主力军。但在生物和医学领域，电子显微镜本身对生物样品的损害，依旧是难以逾越的技术难题。于是不少科学家开始从两条路径上寻求解决之道：一条是研发冷冻电镜技术，这种技术并不改变电子显微镜整体的工作模式，而是从生物样品本身入手，对其进行超低温冷冻处理。这样状态下，即使处在真空环境中，样品也能保持原有的形态特征与生物活性。“由于观测温度低，生物样品也处于含水状态，分子也处于天然状态，样品对辐射的耐受能力得以提高。我们可以将样品冻结在不同状态，观测分子结构的变化。”张德添向记者解释道。瑞士物理学家雅克杜波切特、美国生物学家乔基姆弗兰克和英国生物学家理查德亨德森凭借这项技术分享了2017年度诺贝尔化学奖。新冠疫情暴发后，冷冻电镜技术又为人类研究和抗击疫情做出了突出贡献。2020年，西湖大学周强实验室就利用这种技术，首次成功解析了此次新冠病毒的受体—ACE2的全长结构，让人类对新冠病毒的认识向前迈出了关键性一步。另一条路径是从传统的光学显微镜入手。在电子显微镜的黄金时代，不少科学家就开始着手研制超高分辨率光学显微镜，甚至开始尝试突破一直以来困扰光学显微镜的“阿贝极限”，而“荧光技术”就成为实现这一切的关键。早在19世纪中叶，科学家们就发现：某些物质在吸收波长较短而能量较高的光线（比如紫外光）时，能将光源转化为波长较长的可见光。这种现象后来被定义为“荧光现象”。荧光现象在自然界是普遍存在的，这一现象背后的原理也在20世纪迅速被应用在光学显微镜上。1911年，德国科学家首次研制出荧光显微镜装置，用荧光色素对样品进行荧光染色处理，并以紫外光激发样品的荧光物质发光，但成像效果不佳，而且把荧光物质当作染色剂，和早期的染色剂一样，本身的毒性会伤害活体样品。直到1974年，日本科学家下村修发现了绿色荧光蛋白，其毒性远弱于以往的荧光物质，是对活体标本进行荧光标记的理想材料——这一发现成为日后科学家突破“阿贝极限”的有力武器。时间来到1989年，供职于美国IBM研究中心的科学家莫尔纳首次进行了单分子荧光检测，使得光学显微镜的检测尺度精确到纳米量级成为可能。随后在莫尔纳的基础上，美国科学家贝齐格开发出一套新的显微成像方法：控制样品内的荧光分子，让少量分子发光，借此确定分子中心和每个分子的位置，通过多次观察呈现出纳米尺度的图像。通过这种方法，贝齐格轻而易举地突破了光学显微镜的阿贝极限。几乎在同时，德国科学家斯特凡赫尔在一次光学研究中突发奇想：根据荧光现象原理，如果用镭射光激发样品内的荧光物质发光，同时用另一束镭射光消除样品体内较大物体的荧光，这样就只剩下纳米尺度的分子发射荧光并被探测到，不就能在理论上得到分辨率大于0.2微米的微观成像了吗？他随即开始了试验，并制成了一台全新显微镜，将光学显微镜分辨率下探到了0.1微米的水平。困扰光学显微技术百年的阿贝极限难题，就这样历经几代科学家的呕心沥血，终于在本世纪初被成功攻克。莫尔纳、贝齐格和赫尔三位科学家更是凭借“超分辨率荧光显微技术”分享了2014年度的诺贝尔化学奖。时至今日，在探索微观世界的征途上，光学显微镜和电子显微镜互有长短、相得益彰。当然在实际应用中，科学家越来越依赖于将多种显微成像技术结合使用。比如今年5月，英国弗朗西斯克里克研究所就依托钙化成像技术、体积电子显微技术等多种显微成像技术，成功获得了人类大脑神经网络亚细胞图谱。在未来，多种显微成像技术相结合，各施所长，将进一步完善我们在生物、医学、化学和材料等领域的知识结构，把这个包罗万象的奇妙世界更完整地呈现在我们眼前。

对极限微观的不断探索源于人们原始的求知欲。国际度量衡制度的确立为我们指引了探索的方向。从米到毫米，从毫米到微米，从微米到纳米。当物质被我们不断地“劈碎”。越来越多新性质，新现象，新功能被发现。人们对自然的认识越来越深刻，对物质的操纵也越来越得心应手。 从二十世纪末开始，人类对微观的探索延伸到了纳米领域。在这个从仅比原子高一个层级的尺度范围内，物质展现了一种和宏观截然不同的状态和性质。表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应带来的是超高强度、超高导电性、超流动性、超高催化活性等等无与伦比的属性。 碳纳米管作为第一种人工合成的纳米材料，甫一问世，其超高强度就惊艳世人。它的质量是相同体积钢的六分之一，强度却是铁的10倍。 单壁碳纳米管高度（直径）测量在碳纳米管被研制出来以后，双壁碳纳米管、掺杂碳纳米管、复合碳纳米管等多种材料被源源不断制作出来。极小的尺度和样品多样性，迫切需要一种合适的检测工具。 在纳米尺度下，光学显微镜的分辨率早已鞭长莫及，电子显微镜则因为严格复杂的制样过程使测试门槛令人高不可攀，激光粒度仪对长径比过大的样品测试误差极大也不适合。这时，较合适的观测工具就是原子力显微镜。 原子力显微镜作为专门的纳米材料表征工具，天然具有高分辨率、高环境兼容性、多属性分析种种优势。 原子力显微镜观察的不同碳纳米管形态在生产中，因工艺不同，会产生长短粗细不同的碳纤维。如何有效对这些样品进行归类分析是个大问题。 不同工艺下碳纳米管分散状态借助岛津原子力显微镜配备的颗粒分析软件，则可以自动分析筛选，并对纤维的各种尺度进行统计分析。 极长和极短碳纳米管的自动分类统计同样，对于常见到的纳米材料——纳米颗粒而言，也可以依靠该软件进行统计分析。 纳米颗粒的粒径统计而且，利用原子力显微镜，还可以有效观察同样粒径下颗粒的不同形貌。例如以下两个颗粒，粒径均在100nm左右，如果用激光粒度仪测试，会被归为一类。但是用原子力显微观察，则可以发现很大的不同。 粒径近似的纳米颗粒聚集形态左侧的颗粒是单个粒子，二右侧的则是多个颗粒聚集形成的，在原子力显微镜的小范围观察图像中可以清晰分辨二者的不同。 但是，通常的原子力显微镜很难兼顾大视野和高分辨。要想同时观察统计大量颗粒，就需要用大范围观察，这样一来每个颗粒的细节分辨就难以看清。如果聚焦到一个颗粒上细致观察，则无法从整体上评估样品。 解决的办法就是提高原子力显微镜图像的分辨率。岛津推出了8192*8192点阵的高扫描能力。可以在大范围观察的同时又看清每一个小细节。 兼顾大视野和小细节的超大点阵扫描图像原子力显微镜作为人类眼睛的延伸，像一个精细的触手，细致地捕获纳米材料的形貌、机械性能、电磁学性能等等属性，使这个微乎其微的领域直观地展现在我们眼前，为我们更深更广地认识纳米材料提供了有力帮助。 文中相关仪器介绍详见以下链接：https://www.shimadzu.com.cn/an/surface/spm/index.html 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。