人肾母细胞瘤细胞

个法国研究团队评估了替莫唑胺为基础化放疗添加伊立替康和贝伐珠单抗可否改善不可切除胶质母细胞瘤患者的预后。ESMO 2012期间，B. Chauffert博士报告了该研究结果：患者无进展生存（PFS）有改善趋势。 　　这项Ⅱ随机研究共纳入了120例18～70岁的新发不可切除胶质母细胞瘤患者。患者卡诺夫斯基体能状态评分＞50分，递归分割分析（recursive partitioning analysis ，RPA）5级。患者被随机分组，每组60例，接受4个周新辅助贝伐珠单抗和伊立替康治疗，继以替莫唑胺和贝伐珠单抗同步放疗，或者接受6个月的替莫唑胺同步放疗。 　　临床因素组间平衡性良好，疾病进展后可交叉治疗。治疗16个月时的评估显示，治疗组较对照组PFS期延长，6、12个月时的PFS率分别为65%、31%和41%、18%。但是，两组的总生存（OS）相似，6、12个月的OS率分别为75%、48%和72%和50%。 　　治疗相关严重不良事件发生情况如下：治疗组中，致命性脑出血3例，胆管或消化道穿孔/感染3例（1例致命），非致命性血栓栓塞发作4例；对照组中，非致命性胆管或消化道穿孔/出血2例，非致命性肺部感染1例，非致命性血栓栓塞2例，血栓和/或中性粒细胞减少症4例。 　　研究者作出结论：替莫唑胺为基础化放疗添加伊立替康和贝伐珠单抗新辅助和辅助治疗有改善PFS的趋势，但不改善6和12个月OS。

通过交叉科学研究，提出并发展生物医学前沿新技术，是提高重大疾病治疗效果的重要手段。胶质瘤是发病率和死亡率最高的中枢神经系统肿瘤，其中胶质母细胞瘤（GBM）是最恶性的肿瘤，也被称为“癌中之王”。临床上治疗GBM以外科手术为主，同时辅助放化疗，但是效果非常有限；以手术和替莫唑胺联合治疗为例，5年生存率小于5%。因此，亟需开发新型高效的GBM治疗策略。 GMB治疗棘手的原因主要有三方面。首先， 血脑屏障（BBB） 的存在阻止了药物进入中枢神经系统，需要发展更有效的药物递送策略；其次，单一化疗药物的使用易导致耐药性的产生，需要联合新的肿瘤杀伤手段；另外，GBM具有复杂的肿瘤微环境，对其快速生长和向周围组织的浸润起到重要作用，在治疗的过程中不容忽视。 近日，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室 魏炜 研究员、 马光辉 院士、深圳市第二人民医院 李维平 教授，作为共同通讯作者 在 Signal Transduction and Targeted Therapy 期刊发表了题为： Exploration and functionalization of M1-macrophage extracellular vesicles for effective accumulation in glioblastoma and strong synergistic therapeutic effects 的研究论文。 该研究基于工程化细胞外囊泡发展了“ 免疫调控-化学动力-乏氧激活 ”多级联动的治疗新策略，为胶质母细胞瘤的治疗带来了新思路。针对胶质母细胞瘤治疗难题，过程工程所生化工程国家重点实验室基于具有定向趋化能力的巨噬细胞的细胞外囊泡 （EVs） 和工程化的设计，提出了“免疫调控-化学动力-乏氧激活”多级联动的治疗新策略，并联合深圳市第二人民医院交叉合作，进行了个体化创新药物制剂的研发。 研究团队首先基于胶质瘤患者的临床样本和小鼠模型进行了免疫组化的研究，发现胶质瘤恶性程度越高，肿瘤组织中浸润的M2型巨噬细胞/M1型巨噬细胞的比例也相应更高，并且这些巨噬细胞大多来源于外周血。在此基础上，研究团队提出了以M1巨噬细胞EVs作为载体，一方面可以利用M1巨噬细胞的趋化特性在GBM部位大量蓄积，另一方面可以通过调控巨噬细胞表型实现GBM微环境的免疫调控。图1 胶质瘤样本中巨噬细胞的表型及其来源分析：a. 胶质瘤患者临床样本中巨噬细胞表型分析示意图；b. 不同级别胶质瘤中M1、M2和Ki67（细胞增殖指标）的分析；c. 基于TCGA数据库分析不同级别胶质瘤中M2/M1比例；d. 基于TCGA数据库分析胶质瘤患者瘤内M2/M1比例与生存曲线的关系；e. GBM组织中小胶质细胞和M1巨噬细胞的共定位分析；f. 免疫荧光染色分析GBM组织中小胶质细胞和M2巨噬细胞的共定位；g. 小鼠胶质瘤样本中巨噬细胞表型分析示意图；h. 在不同胶质瘤细胞系（U87MG、G422和GL261）中M1、M2和Ki67的分析；i. 免疫荧光染色分析不同鼠胶质瘤组织中小胶质细胞和M1或M2巨噬细胞的共定位情况；图中标尺均为50 μm 研究团队进一步在M1EVs的细胞膜和内腔差异化装载了化学激发分子对 （CPPO和Ce6） 以及乏氧药物 （AQ4N） ，以此将肿瘤微环境调控、化学激发动力学及肿瘤乏氧治疗合理有序地集成于M1EVs递送系统中。上述仿生剂型 （CCA-M1EVs） 静脉注射后，M1EVs可以携带上述组分穿过BBB进入GBM病灶，进而实现多级联动治疗：M1EVs调控免疫微环境产生大量过氧化氢，从而激发CPPO和Ce6生成自由基 （ROS） ，同时该反应消耗氧气激活细胞毒性药物AQ4N。借助上述作用的协同，在小鼠原位胶质瘤模型和患者来源的 （PDX） 模型上显著抑制了疾病的进程，大幅延长了生存期。图2 基于M1EVs的仿生剂型构建方案、抗肿瘤机制及PDX疗效：a. 仿生剂型的构建示意图；b. 仿生剂型在GBM模型中的累积及免疫调节、化学激发动力学和乏氧触发化疗的协同作用示意图；c. 基于光声成像分析仿生剂型在PDX小鼠GBM病灶中的累积；d. 各组PDX小鼠的抑瘤效果（20天核磁成像）；e. 各组PDX小鼠的生存期分析；f. 各组PDX小鼠的TUNEL分析（标尺50 μm） 十余年来，过程工程所生化室魏炜研究员和马光辉院士创制了一系列仿生递送新剂型，利用其体内的天然路径和属性，在动物模型上成功用于肿瘤、传染病、炎症性疾病的防治，并且部分剂型已通过医院伦理批准进入个体化临床前和临床研究。 深圳市第二人民医院 王晓君 博士和丁辉博士为该论文的共同第一作者，中科院过程工程所生化工程国家重点实验室魏炜研究员、马光辉院士和深圳市第二人民医院李维平教授为共同通讯作者。论文链接 ： https://www.nature.com/articles/s41392-022-00894-3

“ 内吞作用是EGFR功能的一个重要调节因子，在胶质瘤细胞中经常发生失调，并与治疗耐药性有关。然而，在GBM细胞中从未检测过TKIs对EGFR内吞作用的影响。超分辨率dSTORM成像显示，在吉非替尼处理的细胞内膜室中，β1整合素和EGFR非常接近，表明它们潜在的相互作用。有趣的是，整合素的消耗延迟了吉非替尼介导的EGFR内吞作用。EGFR和β1整合素的共内吞作用可能会改变胶质瘤细胞对吉非替尼的反应。利用球状体胶质瘤细胞扩散的体外模型，我们发现α5整合素缺失的细胞比表达α5的细胞对TKIs更敏感。这项工作首次为EGFR TKIs可以触发大量EGFR和α5β1整合素共内吞作用提供了证据，这可能在治疗过程中调节胶质瘤细胞的侵袭性。”01—研究结果1、吉非替尼可引起EGFR的内吞作用胶质母细胞瘤(GBM)是融合星形细胞和少突胶质细胞肿瘤的一个亚群，是最常和比较具有侵袭性的脑肿瘤。GBM的特征是肿瘤间和肿瘤内的异质性和高度侵袭性的表型。表皮生长因子受体(EGFR、HER1、ErbB1)的过表达或突变是GBM中反复发生的分子改变，与不良预后相关。EGFR是一种跨膜受体酪氨酸激酶，属于ERBB家族，负责胶质瘤细胞的增殖、存活、侵袭性和干性调节。尽管EGFR在GBM中是一个有吸引力的治疗靶点，但使用EGFR-酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的靶向治疗未能改善患者的护理。EGFR的过表达驱动胶质母细胞瘤(GBM)细胞的侵袭，但这些肿瘤仍然对EGFR靶向治疗，如酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)产生耐药性。在本研究中，作者发现吉非替尼和其他酪氨酸激酶抑制剂诱导EGFR在早期核内体中积累，从而导致内吞作用增加。此外，TKIs触发另一种膜受体的早期核内蛋白受体重新定位，即纤维连接蛋白受体-β1整合素，这是GBM中一个很有前途的治疗靶点，调节癌细胞的生理EGFR内吞和再循环。EGFR阻断调节失调参与了GBM的进展和侵袭性。然而，TKIs在EGFR迁移中的意义和作用尚不清楚。为了解决这个问题，作者用吉非替尼处理U87GBM细胞，并通过共聚焦显微镜检测了EGFR的定位，考虑到胶质母细胞瘤的异质性，作者分析了吉非替尼在其他3个具有不同水平EGFR表达的细胞系中对EGFR分布的影响。发现吉非替尼增加了T98G和LN443细胞中EEA1/EGFR的共定位，以及LN443、T98和LNZ308细胞中EGF的内吞作用。这些实验表明，吉非替尼在体外导致GBM细胞大量EGFR内吞。图1. 吉非替尼诱导U87细胞的EGFR内吞作用。用DMSO（对照细胞）或吉非替尼(20µM)处理4小时后，免疫检测肌动蛋白（绿）、EGFR（红）和内吞体标记物EEA1（青）。2、整合素和EGFR通过吉非替尼治疗而被共同招募到早期核内体中作者之前的实验清楚地表明，吉非替尼显著增加了EGFR的内吞率。整合素α5β1促进EGFR循环，全基因组基因筛选发现α5β1整合素是EGFR内吞作用的强启动子。因此，作者假设α5β1整合素，作为GBM中潜在的治疗靶点，可能会影响吉非替尼介导的EGFR内吞作用。作者接下来研究了EGFR和整合素是否被运输到相同的核内体。在未处理的细胞中，α5β1整合素和EGFR在质膜上或作为点状细胞内染色，令人惊讶的是，在短期吉非替尼治疗后，α5β1整合素明显被重新分配到大的EGFR阳性核内体中。吉非替尼治疗增加了核周区域整合素/EGFR的共定位，表明这两种受体在同一核内体中募集。图2. 吉非替尼引起EGFR和α5β1整合素的共内吞作用。用载体（对照）或吉非替尼处理的U87细胞的共聚焦图像。EGFR和β1的免疫检测接下来，作者对瞬时表达α5-GFP或Rab5-YFP的U87细胞进行了免疫标记和共聚焦分析。在吉非替尼治疗后，整合素β1和EGFR均定位于rab5阳性的早期核内体同样，EGFR和α5-GFP均在eea1阳性的早期核内体中被发现图3. 表达Rab5-YFP或α5-eGFP的U87细胞经吉非替尼处理后的共聚焦图像。在核周区域的插入物的高倍放大图像。箭头突出了标记有EGFR、整合素和早期核内体标记的囊泡接下来，作者使用2色dSTORM超分辨率显微镜来整合早期核内体中整合素和EGFR之间的潜在相互作用。在吉非替尼处理的细胞中，显示EGFR和整合素β1标记在核内体样结构中存在强覆盖，但不是在细胞外周处，这表明这两种受体更可能在核内体中相互作用，而不是在质膜上相互作用。此外，作者也在另外三个GBM细胞系中观察到内吞体整合素/EGFR共标记。图4. 吉非替尼处理的细胞的双色dSTORM图像显示细胞外周和核内体上的EGFR/β1整合素复合体02—研究总结 综上所述，这些数据表明EGFRTKIs增加了GBM细胞早期内吞体中EGFR的内吞作用和α5β1整合素的共积累。EGFR/α5β1整合素内吞作用和膜破坏。由于这些受体在癌细胞的侵袭和传播中发挥着关键作用，未来的挑战将评估TKIs对整合素生物学功能的影响，以及整合素/EGFR如何改变TKIs处理的细胞的内吞作用可能有助于GBM细胞逃避。并且，最近的一份报告强调了靶向治疗的靶标细胞毒性被低估的重要性。这项工作强调了需要更好地了解药物机制，以确定适当的生物标志物来预测药物的疗效。因此，描述吉非替尼等药物对内体转运的影响并揭示参与这些机制的分子将是很重要的。这可能为新的治疗方案提供理论基础，并改进脑肿瘤的精确医学方法。在本研究中，研究者主要借助STORM技术在更深一层次了解整合素之间的位置关系。这项2014年诺贝尔化学奖的发现已在国内实现产业化。宁波力显智能科技有限公司(INVIEW)现已发布超高分辨率显微系统iSTORM，采用3D随机光学重构技术、高精度细胞实时锁定技术、多通道同时成像技术等，以纳米级观测精度、高稳定性、广泛环境适用、快速成像、简易操作等优异特性，获得了超过50家科研小组和100多位科研人员的高度认可。参考文献：1. Blandin, Anne-Florence, et al. "Gefitinib induces EGFR and α5β1 integrin co-endocytosis in glioblastoma cells." Cellular and Molecular Life Sciences 78.6 (2021): 2949-2962.