水井坊氨基酸杆菌

话说为了应对市场需求，需要进行硫酸粘杆菌素的检测方法的开发，查找标准方法，大致浏览下用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]液质[/color][/url]进行检测，基本资源有满足，开始工作。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/emyc1007.gif[/img]1.化合物性质及结构先介绍下硫酸粘杆菌素，分子结构图如下：[img=,200,197]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030927_01_3246897_3.gif[/img]分子式：2(C[sub]52[/sub]H[sub]98[/sub]N[sub]16[/sub]O[sub]13[/sub]).5(H[sub]2[/sub]SO[sub]4[/sub])，分子量：2801.27，纯度80.1%，PH3-7.5范围内稳定，为硫酸粘杆菌素A和硫酸粘杆菌素B的混合物。2. 配制标样。用十万分之一的天平，称取硫酸粘杆菌素10.20mg至10mL容量瓶中，用换算成硫酸粘杆菌素浓度C=2=1347.98mg/L,用体积比V[sub]1[/sub]+V[sub]2[/sub]=1+4的0.1甲酸乙腈溶液溶解，并配置成10mg/L工作液。3. 仪器方法建立。3.1质谱条件3.1.1寻找母离子硫酸粘杆菌素是由氨基酸缩合而成的碱性多肽类抗生素，在一级质谱中易与多个H +结合成多电荷正离子,初步选定流动相A1+B2=3+7，接双通，流速0.2mL/min,进浓度为5.0mg/L的标准品1μL，初始Fragment为100,用MS2 SCAN正模式扫描，得到ESI正离子模式全扫描质谱图如图所示，硫酸粘杆菌素的三电荷离子[sup]3 +[/sup]响应最高，，进而确定它们的母离子(m /z) 分别为390. 5、385. 8。[img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030929_01_3246897_3.png[/img]3.1.2优化Fragment电压将扫描模式该为MS2 SIM模式，将得到的Precursor Ion输入，驻留时间Dwell设为20，Fragment从1v-200V范围设置，在其他仪器条件不变的情况下进样，得到不同Fragment下的响应强度图，初步选定其Fragment在100V左右，进一步在100左右细化Fragment，最终选定硫酸粘杆菌素A和B的Fragment为110V。[img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030930_02_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030931_01_3246897_3.png[/img]3.1.3 ProductIon和CE优化将扫描模式选为Product Ion模式，将390.5和385.8作为Precursor Ion，MS2 From 100，MS2 To 400（包含母离子），Fragment选定优化好的110V，碰撞能按照CE=左右寻找，得到子离子，选定包含国标的离子，并得到大致CE范围，将扫描模式选为MRM模式，在得到的初步CE左右，进一步优化得到最佳的CE值。[align=center][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030932_01_3246897_3.png[/img][/align]综上，得到硫酸粘杆菌素的质谱条件，如下表： [b]表 1 目标化合物的质谱分析条件[/b][table=745][tr][td=1,2]No.[/td][td=1,2]中文名称[/td][td=1,2]英文名称[/td][td=1,2]CAS[/td][td]前体[/td][td]产物[/td][td]去簇电压[/td][td=1,2]碰撞能[/td][td]加速电压[/td][/tr][tr][td]离子[/td][td]离子[/td][td](V)[/td][td](V)[/td][/tr][tr][td=1,3]1[/td][td=1,3]硫酸粘杆菌素A[/td][td=1,3]Ceftriaxone Sodium[/td][td=1,3]1264-72-8[/td][td=1,3]390.5[/td][td] 384.7*[/td][td]110[/td][td]5[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]378.8[/td][td]110[/td][td]8[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]100.9[/td][td]110[/td][td]20[/td][td]4[/td][/tr][tr][td=1,3]2[/td][td=1,3]硫酸粘杆菌素B[/td][td=1,3]Ceftriaxone Sodium[/td][td=1,3]1264-72-8[/td][td=1,3]385.8[/td][td] 380.0*[/td][td]110[/td][td]5[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]373.9[/td][td]110[/td][td]5[/td][td]4[/td][/tr][tr][td]100.9[/td][td]110[/td][td]20[/td][td]4[/td][/tr][/table][color=#231F20]注：[/color][color=#231F20]* [/color][color=#231F20]为定量离子。[/color][color=#231f20]3.2 流动相条件液相条件的寻找，首先确定流动相，在双通的用乙腈+0.1%甲酸水=7+3、乙腈+0.1%甲酸水=5+5、乙腈+0.1%甲酸水=3+7 3种比例条件下看峰型和响应的大小，选定乙腈+0.1%甲酸水=7+3时出峰最好，然后乙腈+0.1%甲酸水=7+3、乙腈+0.1%甲酸水5mmol/L乙酸铵=7+3、0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水=7+3，出峰强度和峰型与乙腈+0.1%甲酸水=7+3基本一样，确定硫酸粘杆菌素在流动相比例乙腈+0.1%甲酸水=7+3时出峰最佳，先接色谱柱，笔者试验Agilent EclipsePlus C18 RRHD 1.8μm2.1*100mm，Waters HSS T3 1.8μm，Agilent XDB-C18 1.8μm，最终发现Agilent XDB-C18 1.8μm，对目标化合物分离效果及峰型最好。[/color][color=#231f20][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030935_01_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030935_03_3246897_3.png[/img][/color][color=#231f20]4.用建立好的仪器方法配置标曲硫酸粘杆菌素 St50μg/L, 100μg/L,200μg/L,400μg/L,600μg/L.[/color][color=#231f20][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030937_01_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030937_02_3246897_3.png[/img][/color][color=#231f20]4.前处理条件 4.1.化合物分析粘杆菌素为多肽类抗生素，含有多个氨基，极性很强，易溶于水，微溶于甲醇等有机溶液，PH3-7.5范围内稳定，可用HLB和阳离子交换柱进行净化。[/color][color=#231f20]4.2试验方法[/color][color=#231f20]4.2.1 前期试验[/color][color=#231f20] 通过国标方法及文献资料，选择4%三氯乙酸+4%乙酸铅， 10%三氯乙酸：乙腈=3:7溶液作为提取溶剂， 提取离心后 ，用正己烷净化 ，过500mgHLB ，3mL水淋洗，3mL5%甲醇/水淋洗，6mL甲醇洗脱 35℃旋转蒸干或者N[sub]2[/sub]吹干上机分析，加标小瓶中理论值100μg/L，全程试剂空白，猪肉未知样品，及加标回收，均一样大，sp100μg/L有明显的基质干扰，单纯的标准品35℃旋转蒸干或者N[sub]2[/sub]吹干上机分析，无回收。4.2.2前期试验分析与总结：a.最终进样不能吹干或旋干，选择N[sub]2[/sub]（35℃以下）吹至1mL以下；b.HLB洗脱接受后，溶液较浑浊，说明HLB净化效果不佳；c.提取液4%三氯乙酸+4%乙酸铅较其他两种浑浊；d.分析化合物有多个氨基可选择离子交换柱， WCX柱。[/color][color=#231f20]4.2.2 再次试验[/color][color=#231f20]称样5.0g--- 添加标准品1mg/L×100μL[/color][color=#231f20]---加入10%三氯乙酸：乙腈=3:7 15mL----充分混匀，超声20min，离心 [color=#231f20]----[/color]上清液倒入新离心管[/color][color=#231f20][color=#231f20]----[/color] 残渣继续用10%三氯乙酸：乙腈=3:7 10mL提取一遍[/color][color=#231f20][color=#231f20]----[/color]合并上清液，用氨水调PH=7[color=#231f20]----[/color] 加入10mL乙腈饱和的正己烷，充分混匀，离心 [color=#231f20]----[/color]弃去正己烷层，下层过WCX（200mg,6cc），甲醇水平衡[/color][color=#231f20] ----5mL水淋洗 ----5mL甲醇淋洗----6mL甲酸：甲醇=1:4洗脱，接收[color=#231f20]----[/color]用N2在40℃下吹至1mL左右，用水定容至2mL，过0.22μm滤膜。[/color][color=#231f20]线性范围：25μg/L，50μg/L,100μg/L,150μg/L,200μg/L基质标曲。得到如下谱图：[/color][color=#231f20][img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030947_02_3246897_3.png[/img] [img=,400,249]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/07/201707030947_03_3246897_3.png[/img][/color][color=#231f20]回收率在70%左右。[/color][color=#231f20]综上：对于硫酸粘杆菌素，提取试剂用酸性，选用离子交换柱比HLB柱净化干净，定容之前溶液勿吹干（多次失败得出）。以上，是本人做硫酸粘杆菌素仪器方法开发时的一些经验和体会，希望能给大家带来帮助，也希望大家能多提提意见，共同进步，谢谢大家。[img]http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09511.gif[/img][/color][color=#231f20][/color][color=#231f20][/color][align=center][/align]