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Waters H-class检测脱氧鸟苷标准品,浓度低的标准品反而比浓度高的峰面积大,这是怎么回事呢?
我要检测的指标是8-羟基脱氧鸟苷酸,它是DNA中鸟嘌呤的氧化产物,在尿中以原形代谢,所以我用C-18固相萃取柱(6ml,500mg)萃取尿液,下面是处理方法:尿液在10℃1500g.离心5分钟除去沉淀,上清液以0.2μm微孔滤膜过滤,然后上清液用C-18固相萃取柱(6ml,500mg)萃取,将C-18固相萃取柱连接于12端口的真空泵,C-18柱事先用5ml甲醇 和5ml水平衡,然后,以2ml的尿液上柱,柱子用去离子水配置的3ml 6℅甲醇冲洗,接下来柱子用6ml去离子水冲洗,8-OhdG用去离子水配置的2ml 10℅乙腈洗提,收集洗提液,有机溶剂在纯氮60℃,30分钟下蒸发,最后,样品的体积用水调整到0.5ml,50μl样品上高压液相柱。现在我的问题是我在尿液中加入标准品或单独加入标准品固相萃取柱对其没有保留,既是我在尿样中8-OH-dG峰并不增加,而单独上标准品在上柱是就有标准品大量留出,而在洗脱液中含量很低。各位专家,请帮助解决一下!
最近在分析三磷酸脱氧核苷(dCTP, dTTP, dATP, dGTP)。用的是强阴离子交换色谱,紫外检测器(DAD),磷酸盐缓冲液,安捷伦1200系统。色谱柱用的是SAX柱子, 125*4.6 mm, 5um 填料。紫外波长260 nm. 以前实验室就是用 0.35 M 的磷酸二氢钾做等度洗脱,所以基线很平稳。但是因为有两个化合物保留时间太长,峰很宽,所以想改用磷酸盐浓度梯度洗脱。可是当我做0.1 M 到 0.5 M的梯度时, 基线吸收变高很多,以至最后出来的两个峰在上升的基线上了(图传不上来,一会儿再试试)。如果运行pH梯度,我的这款色谱柱需要很长的平衡时间。我买了Sigma 的 分析纯和HPLC纯度的磷酸盐;也在Thermo买了HPLC纯度的,但是情况都差不多。Bio-rad有净化磷酸盐的材料,但是用起来很麻烦,而且还不知道真的用起来效果如何。想在此求助高手们如何解决磷酸盐高浓度基线漂移问题的?或者有没有更好的用紫外检测器分析这些三磷酸形式核苷的方法 (质谱除外,条件不允许啊)?听说有的紫外检测器是可以补偿基线漂移的,不知道这安捷伦的检测器是否有这个功能?在设立紫外参数的时候,在检测波长的后面有一个参照波长,这个是否对检测有什么帮助和影响。先谢谢大家的热心帮助了!http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/08/201408142221_510356_2799469_3.png