耐药性分析国家参考

农业部近日印发《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017—2020年)(征求意见稿)》，拟在“十三五”期间分区域建立5-8家专业化区域实验室，在全国范围内建立100-120家细菌耐药性监测站(点)，布局合理的动物源细菌耐药监测网。以省级以上兽药监察(检验)机构为主体，建立健全市县级兽用抗菌药物监测机构，完成31种兽用抗菌药物272项限量指标以及63项抗菌药物残留检测方法标准制定。　　计划意见稿还指出，凭借龙头企业技术优势，创立全国兽用抗菌药物科技创新联盟，围绕动物专用抗菌药物、动物源细菌耐药性检测仪器设备和以中兽药、低聚糖、微生态制剂、噬菌体等为代表的抗生素替代品和养殖领域新型耐药性控制技术与产品等领域，开展关键技术创新集成。鼓励耐药菌高通量检测仪器设备、监测网络设备以及基层兽医实验室微生物检测仪器设备的研发。鼓励开展细菌耐药分子流行病学和致病性研究，为制订耐药控制策略与研究开发新药物新技术提供科学依据。　　通知原文如下：全国遏制动物源细菌耐药性行动计划(2017—2020年)(征求意见稿)　　为加强兽用抗菌药物管理，综合治理兽药残留问题，有效遏制动物源细菌耐药，保障养殖业生产安全、动物源性食品安全、公共卫生安全和生态环境安全，维护人民群众身体健康，促进经济社会持续健康发展，根据《遏制细菌耐药国家行动计划(2016-2020年)》《“十三五”国家食品安全规划》和《“十三五”国家农产品质量安全提升规划》，制定本行动计划。　　一、前言　　我国是畜禽、水产养殖大国，也是兽用抗菌药物生产和使用大国。兽用抗菌药物在防治动物疾病、提高养殖效益、保障畜禽水产品有效供给中发挥了重要作用。当前，兽用抗菌药物市场秩序不规范、养殖环节使用不合理、科学安全用药意识不强等问题较为突出，动物源细菌耐药性风险评估和防控体系薄弱，细菌耐药形势严峻。动物源细菌耐药率上升，致使兽用抗菌药物疗效降低，迫使养殖用药增加，从而造成兽用抗菌药物毒副作用加剧、兽药残留超标风险提高，严重威胁畜禽水产品质量安全和公共卫生安全，给人类和动物健康带来很大隐患。综合治理兽用抗菌药物，遏制动物源细菌耐药性，是推动养殖业供给侧结构性改革，保障畜禽水产品质量安全的关键环节。当前亟需建立和加强动物源细菌耐药性和抗菌药物残留监测治理体系，提高风险管控能力。　　二、工作目标　　动物源细菌耐药性和抗菌药物残留监测防控能力、养殖环节规范用药水平、畜禽水产品质量安全水平和人民群众满意度明显提高。到2020年，实现以下目标：　　(一)建立健全兽用抗菌药物应用和细菌耐药性监测技术标准和考核体系，形成覆盖全国、布局合理、运行顺畅的动物源细菌耐药性监测实验室网络。　　(二)兽用抗菌药物凭兽医处方销售的比例达到50% 逐步推进兽用抗菌药物减量化使用。　　(三)人兽共用抗菌药物或易产生交叉耐药性的抗菌药物作为动物促生长剂逐步退出 研发和推广低毒、低残留新兽药产品100种，淘汰高风险兽药产品100种。　　(四)结合大专院校专业教育、新型农民培训和现代农业产业体系、对养殖一线兽医和养殖从业人员开展相关法律、技能宣传培训，掌握兽用抗菌药物科学使用知识。　　(五)促生长兽用抗菌药物使用量降低，动物源主要细菌耐药率增长趋势得到有效控制。畜禽水产品兽用抗菌药物残留合格率保持在97%以上。　　三、重点任务　　为实现上述目标任务，重点围绕促生长兽用抗菌药物逐步退出、抗菌药物临床应用监管、兽用抗菌药物耐药性监测和兽药残留控制网络规划布局、兽用抗菌药使用减量化示范创建和从业人员宣传培训等方面，实施“六项工程”：　　(一)实施促生长兽用抗菌药物逐步退出工程　　加强重要兽用抗菌药物风险评估和预警提示，加大安全风险评估力度，明确评估时间表和技术路线图，加快淘汰风险隐患品种。逐步推进风险评估工作：　　1.开展促生长人兽共用抗菌药物风险评估工作，如金霉素预混剂等产品，参照WHO、FAO、CAC、OIE等国际组织有关标准，结合我国实际，计划到2020年前完成清理退出工作。　　2.开展促生长动物专用抗菌药物风险评估工作，如黄霉素预混剂等产品，收集、分析和评价相关技术资料，有针对性地开展残留和耐药监测工作，到2020年形成保留或退出的政策建议。　　3.开展喹噁啉类抗菌药物风险评估工作，如乙酰甲喹、喹乙醇、喹烯酮等品种，收集监测数据，分析评价技术资料，到2020年形成逐步退出方案。　　(二)实施兽用抗菌药物临床应用监管工程　　1.完善兽用抗菌药物注册制度。加快兽用抗菌药物审评审批制度改革，推进人用、兽用抗菌药物分类管理，鼓励研制新型动物专用抗菌药物。人用重要抗菌药物、长期添加用于促生长作用、易蓄积残留超标、易产生交叉耐药性的抗菌药物不予批准。依据政策加快审批用于防治耐药菌感染相关创新药物以及疫苗。依据抗菌药物的重要性、交叉耐药和临床应用品种等情况确定应用级别，研究制定兽用抗菌药物分级管理办法和分级目录。逐步实施兽用抗菌药物环境危害性评估工作。　　2.规范养殖环节兽用抗菌药使用。制定发布《兽用抗菌药物兽医临床使用指导原则》，进一步规范兽医临床使用行为。推进养殖环节社会化兽医服务体系建设，推动实施兽用处方药管理、休药期等兽药安全使用制度。开展兽药使用质量管理规范研究工作，建立养殖主体兽药采购、储存、使用等各环节管理要求和操作规程，系统规范兽药使用行为。开展饲料药物添加剂规范、禁用兽药清单、休药期规定等修订工作，完善技术规范。　　3.加强饲料生产环节兽药使用监管。加快推动饲料生产环节使用兽药的监测和预警分析工作，实施饲料中兽药监测计划，持续完善相关检测标准和判定标准，重拳打击非法添加药物等违法行为，形成监管长效机制。　　4.建立兽用抗菌药物应用监测网。设立全国兽用抗菌药物应用监测中心和区域分中心，依托兽用抗菌药物生产企业、诊疗机构、重点养殖企业、畜禽养殖大县等形成监测网络。通过兽用抗菌药物“二维码”追溯系统实时监测兽用抗菌药物临床应用种类、数量、流向和变化规律，分析抗菌药物临床应用与耐药性和残留的相关性。　　(三)实施兽用抗菌药物耐药性监测工程　　1.完善动物源细菌耐药监测网。建设国家动物源细菌耐药性监测中心，制订养殖领域抗菌药物使用与耐药性监测标准和监测方案。分区域建立5-8家专业化区域实验室，在全国范围内建立100-120家细菌耐药性监测站(点)。构建以国家实验室、区域实验室为主体，以大专院校、科研院所等实验室为补充，分工明确、布局合理的动物源细菌耐药监测网。　　2.加强动物源细菌耐药监测。开展普遍监测、主动监测和目标监测工作。覆盖不同领域、不同养殖方式、不同品种的养殖场(户)和有代表性的畜禽水产品流通市场。通过国家和省市动物源细菌耐药性监测网，逐级上传药敏试验结果以及MIC频率分布 抗菌药物和饲料药物添加剂以种类和剂量分布频率逐级上传。获得动物源细菌耐药流行病学数据，支持耐药菌感染诊断、治疗与控制。　　3.加强医疗与养殖领域合作。建立医疗与养殖领域抗菌药物合理应用和细菌耐药监测网络及其数据分析和发布的联通机制，实现两个领域的监测结果相互借鉴参考。　　(四)实施兽用抗菌药物残留控制工程　　1.加强畜禽水产品的抗菌药物残留监测工作。以省级以上兽药监察(检验)机构为主体，建立健全市县级兽用抗菌药物监测机构，吸收第三方检测力量，持续实施抗菌药物残留监控计划，严格实施官方抽样、盲样检测、阳性追溯等制度，依法严肃查处问题产品。完成31种兽用抗菌药物272项限量指标以及63项抗菌药物残留检测方法标准制定。　　2.加强抗菌药物和耐药菌的环境污染防治。新、改、扩建兽药企业、养殖企业必须严格执行环境影响评价制度。加强养殖粪污抗菌药物残留检测，建立养殖废弃物抗菌药物残留状况动态监测控体系，推广先进的环境控制技术、粪污处理技术，促进生态养殖发展。　　(五)实施兽用抗菌药物使用减量化示范创建工程　　在奶牛养殖大县、生猪养殖大县和全国绿色养殖示范县选择生猪、家禽和奶牛等优势品种，遴选中兽药、微生态制剂等低毒、低残留兽用抗菌药物产品中可推广使用的品种名录，研制流行菌株的细菌疫苗，研究推广相关补贴制度 先行试点、总结模式、逐步推广，开展兽用抗菌药物使用减量化示范创建工程，从源头减少兽用抗菌药物使用量。　　(六)实施从业人员培训和公众宣传教育工程　　加强养殖业与兽医从业人员教育。将兽用抗菌药物使用规范纳入新型职业农民培育项目课程体系和执业兽医资格考试内容。鼓励有条件的大专院校开设抗菌药物合理使用相关课程。加强兽医和养殖业从业人员抗菌药物合理使用培训考核。充分利用广播、电视等传统媒体和互联网、微博、微信等新媒体，广泛宣传抗菌药物合理使用知识，提高公众对细菌耐药性危机的认知度。与世界卫生组织同步开展兽用抗菌药物合理应用宣传周活动。　　四、能力建设　　(一)提升信息化能力。完善兽用抗菌药物生产企业、兽用抗菌药物产品批准文号等基础信息数据库，推动省市县三级配备必要的软硬件设施设备，实现与国家兽用抗菌药物追溯系统对接，深入推进兽药“二维码”追溯系统建设，提高兽用抗菌药物生产、经营、使用环节等信息采集、传输、汇总、分析和评估能力。　　(二)提升标准化能力。建立适合我国国情的动物源细菌耐药性检测监测标准体系，开展实验室能力比对，为监测工作提供有力支撑。制定统一的耐药性检测监测相关标准，认证相应的检测仪器、试剂，制定各级监测网的管理规则和数据库标准，分区域建立耐药性监测参比实验室，指导建立菌种库、标本库。　　(三)提升科技支撑能力。发挥科研院所、龙头企业技术优势，创立全国兽用抗菌药物科技创新联盟，围绕动物专用抗菌药物、动物源细菌耐药性检测仪器设备和以中兽药、低聚糖、微生态制剂、噬菌体等为代表的抗生素替代品和养殖领域新型耐药性控制技术与产品等领域，开展关键技术创新集成。鼓励耐药菌高通量检测仪器设备、监测网络设备以及基层兽医实验室微生物检测仪器设备的研发。鼓励开展细菌耐药分子流行病学和致病性研究，为制订耐药控制策略与研究开发新药物新技术提供科学依据。　　(四)提升国际合作能力。主动参与WHO、OIE、FAO等相关国际组织开展的耐药性防控策略与CLSI、EUCAST标准制修订等相关工作，与其他国家和地区开展动物源细菌耐药性监测协作，控制耐药菌跨地区跨国界传播。加强与发达国家抗菌药物残留控制机构及重要国际组织合作，参与国际规则和标准制定，主动应对国际畜禽水产品抗菌药物残留问题突发事件。　　五、保障措施　　(一)加强组织领导。各地、各有关部门要深刻认识做好动物源细菌耐药防控工作的极端重要性，强化组织领导。要根据本计划确定的发展目标和主要任务，认真履行日常监管、监督抽检责任。要强化责任落实，明确养殖和屠宰者的主体责任，各级监管部门的监管责任，层层传导责任压力，切实将各项工作任务落到实处。　　(二)加大政策支持。积极争取发改、财政、科技等部门支持，加大动物源细菌耐药性防控体系建设、监测评估、监督抽查、中兽药补贴和抗菌药物减量化示范创建等工作的支持力度 逐步建立多元化投入机制，鼓励和引导企业和社会资金投入。　　(三)发挥专家力量。改组成立全国兽药残留和兽用抗菌药物控制专家委员会，为动物源细菌耐药监测、监管体系建设与完善提供专业指导 承担兽用抗菌药物耐药性风险评估任务，提供风险管理和政策建议。在相关国家现代农业产业技术体系中增设抗菌药物替代研发、细菌耐药机制研究、耐药检测方法与标准研究等岗位，鼓励各地建设兽用抗菌药创新团队。　　(四)落实目标考核。推动各地将兽用抗菌药物使用监管及动物源细菌耐药控制纳入地方政府考核范围，对动物源细菌耐药性监管体系、耐药率、兽药残留超标率、条件保障和经费预算等指标进行量化考核。农业部制定考核评价标准，按年度、区域、进度进行量化、细化，各地要根据工作要求，将工作目标和任务措施分解到具体部门和养殖企业，确保行动计划有效落实。

导读自青霉素发现以来，抗生素已经成为人类对抗细菌的最有效武器，挽救了无数人的生命，但随着抗生素使用上的无节制，抗生素耐药性已成为一个重大的全球问题。因此了解微生物对抗生素适应的分子机制成为抗击抗生素耐药性（AMR）的一个重要途径。近日，法国巴斯德研究所的科学家运用转录组测序、naica® 微滴芯片数字PCR等技术证实VchM（霍乱弧菌特有甲基转移酶）参与应对氨基糖苷类抗生素的应激反应，这表明，DNA甲基化在氨基糖苷类抗生素的耐药机制中也发挥着重要作用，该文章刊载于《PLOS GENETICS》。应用亮点：▶ 运用naica® 微滴芯片数字PCR系统分析霍乱弧菌操纵子表达情况。▶ VchM缺失会导致生长缺陷，但却可以使霍乱弧菌对氨基糖苷产生应激。▶ VchM直接调节groES-2（伴侣蛋白编码基因）的胞嘧啶甲基化，从而改变其表达情况，影响霍乱弧菌耐药性。氨基糖苷（AGs，如：妥布霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素和新霉素）是一类针对细菌核糖体小亚基的抗生素，其破坏翻译保真度，增加细胞中错误折叠蛋白质的水平。而本文的研究主要针对霍乱弧菌对其的耐药性机理。科学家们在之前的研究中发现，特定DNA甲基转移酶基因突变（VchM）的霍乱弧菌相比WT具有更强的耐药性，这表明DNA甲基化可能在霍乱弧菌适应AGs中发挥作用。VchM编码一种Orphan m5C DNA甲基转移酶，导致5‘-RCCGGY-3’基序的胞嘧啶甲基化，虽然VchM的缺失会导致生长缺陷，但霍乱弧菌细胞可以在亚致死浓度和致死浓度的抗生素下对氨基糖苷应激。▲图1：霍乱弧菌ΔVchM对亚致死浓度氨基糖苷的敏感性较低。GAs类，TOB（妥布霉素），0.6 μg/ml、GEN（庆大霉素），0.5 μg/ml、NEO（新霉素），2.0 μg/ml；非Gas类，CAM（氯霉素），0.4 μg/ml和CARB（β -内酰胺类西林），2.5 μg/ml对于ΔVchM霍乱弧菌的转录组测序和遗传分析发现，ΔVchM菌株中有4个直接参与蛋白质折叠的基因被上调。包括groEL-1，groEL-2，groES-1，groES-2。通过naica® 微滴芯片数字PCR系统对基因表达进行验证分析发现，ΔVchM霍乱弧菌中groES-2的表达在不同时期均有较大上调。进一步通过缺失验证表明了groESL-2对ΔVchM的抗生素高耐受性的作用。▲图2：ΔVchM菌株中groESL-2操纵子上调(对数生长期，Exp, OD600 ≈ 0.3；指数生长期，Stat, OD600 ≈ 1.8–2.0)在groESL-2区域观察存在四个VchM甲基化基序存在。进一步对基序分析发现，破坏这些基序会导致groESL-2基因表达增加（如图3）。且基序破环越多，则导致的表达上调更加明显。同时，ΔVchM中的groESL-2基因表达一直高于基序突变，表明还存在其他因素与甲基化协同控制groESL-2表达。这些结果表明，在霍乱杆菌中，一组特定的伴侣蛋白编码基因受DNA胞嘧啶甲基化的控制，将DNA甲基化与伴侣蛋白表达的调节和对抗生素的耐受联系起来。▲图3：在WT中，groESL-2区域的VchM位点突变导致基因表达增加法国巴斯德研究所是世界上最著名的研究所之一，成立130余年来一直走在世界科技前沿，是微生物学、免疫学、传染病学等学科的起源地，曾开发出狂犬病疫苗、天花疫苗、流感疫苗、黄热病疫苗等多个造福人类的疫苗产品，并培养了10名诺贝尔奖生理学或医学奖获得者，实现研究、教育、健康、创新“四位一体”的研究机构。

导读结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一。如何准确快速诊断和鉴别诊断结核病及其耐药性，对指导临床开展早期精准有效治疗至关重要。本篇将主要介绍核酸质谱技术在鉴定结核病及其耐药性方面的内容……结核病是严重威胁人类健康的重要传染性疾病之一。来自世界卫生组织的数据显示：2021年全球有1060万例新发结核病患者，死亡近160万例，新增45万例耐多药/利福平耐药结核病患者；我国新发78万例结核病患者，新增耐多药/利福平耐药结核病患者约3.3万例，是全球结核病及耐药结核病高负担国家之一；肺外结核占所有结核病的15%～40%，因其容易导致器官或组织功能性损伤和器质性障碍而成为近年来结核病领域关注的重点（数据摘自《中国防痨杂志》）。因此，准确快速诊断和鉴别诊断结核病及其耐药性，对指导临床开展早期精准有效治疗至关重要。常见的结核病及其耐药性的诊断方法目前对诊断结核病及其耐药性的方法有：实时荧光定量PCR技术、恒温扩增技术、基因芯片/线性探针技术、基因测序技术和核酸质谱技术等。核酸质谱技术鉴定结核分枝杆菌的优势目前，核酸质谱技术可鉴定结核分枝杆菌复合群8个亚种和40个非分枝杆菌菌种及其亚种，合计48个分枝杆菌菌种和亚种，几乎覆盖了临床上分枝杆菌病的所有常见致病菌。而对于分枝杆菌的保守基因片段，核酸质谱技术可以针对基因的多态性进行设计和鉴定。其优势如下：01敏感度高：目前核酸扩增技术的结核分枝杆菌检测均基于IS6110、IS1081等位点进行扩增，选择其中的1个或2个，而核酸质谱技术可在此基础上增加其他位点的多肽性检测；02特异性高：核酸质谱可以用多基因结果验证，保证结核分枝杆菌检测的特异度；03耐药性检测方面应用范围广：几乎覆盖了目前常用的抗结核和抗分枝杆菌病的药物，检测针对性强、准确性高；04检测速度快：近百例样本同时进行检测分析，检测周期短于一代和二代测序，对少量样本也能进行多基因多位点检测。无需培养，实现单个核苷酸碱基的直接鉴定。核酸质谱技术鉴定结核分枝杆菌抗结核药物目前核酸质谱技术可检测结核分枝杆菌4种一线抗结核药物（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇）和常用的二线抗结核药物（氟喹诺酮类、链霉素等）的耐药基因型。药物的检测结果与表型药物敏感性（简称“药敏”）试验结果具有很好的一致性；并可根据耐药相关的基因多态性进行设计，从而获得相关的耐药基因突变结果。可用于检测常用一线、二线抗结核药物的耐药基因位点。如利福平和异烟肼等。* 利福平：利福平的耐药决定区集中了95%以上的临床耐药菌株。核酸质谱技术能够检测出此决定区的所有突变位点，以及区外的常见位点，从而较全面地预测利福平耐药性。同时，核酸质谱法检测的结果还会提示是低水平耐药还是高水平耐药，从而避免出现使用药敏方法检测时的遗漏。综上所述：对于结核病的诊断，我国主要通过患者的临床表现、影像学检查结果及免疫学检测结果进行综合分析，但缺点是检测时间长及准确率有待提高。近年来，分子诊断技术包括核酸质谱技术的迅速崛起和发展，为结核病的快速诊断提供了新的方法。东西分析经过数年的开发，基于飞行时间质谱技术平台开发出快速鉴定结核分枝杆菌及其抗结核药物的应用方案。基于用户的具体需求，通过核酸质谱这个快速及强有力的辅助诊断工具，东西分析可对结核分枝杆菌进行精确到种乃至亚种水平的鉴定，从而为临床提供早期精准诊断和治疗参考建议。对于阳性的检测结果，还可进一步进行耐药性检测。即根据检测结果，临床医生不仅能够进行高效精准的结核病诊断，还能够及时调整治疗药物，从而优化治疗方案。Ebio Reader 3700 Plus飞行时间质谱仪操作简单无需复杂的样品前处理。性能稳定长寿命固体激光器；飞行管随环境温度、湿度的变化小，保证检测的稳定 ；高效网筛离子源，提高仪器的灵敏度 ；PIE高压脉冲电源控制，实现离子的延迟推斥，提高整体仪器的分辨能力。软件智能基于神经网络聚合分类法的人工智能软件；拥有强大数据库，实现对菌种的实时鉴定；具备聚类分析功能，可进行T-test等数据分析；具有自建库功能，可根据用户实际情况建立自有菌种库 ；可根据用户具体需求，进行相应升级，用于疾病蛋白标志物和核酸基因分型的检测。应用范围广广泛用于临床、疾控、食品安全、农业、工业、出入境检疫等领域。往期回顾BREAK AWAY核酸质谱之漫话一：什么是核酸质谱