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[size=20px][color=#93c6bc][b]鉴别[/b][/color][/size][size=16px][color=#e2a4a4]|[/color][/size] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font][font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体]聚合酶链式反应法。[/font] [b][font=宋体]模板DNA提取[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]取本品0.5g,置乳钵中,加液氮适量,充分研磨使成粉末,取50mg,置2.0ml离心管中,加入提取缓冲液200μl(含1%聚乙烯吡咯烷酮-40和1%曲拉通 X-100的0.5mol/L氢氧化钠溶液),充分混匀;加入0.1mol/L Tris-盐酸溶液(pH 8.0)800μl,混匀,离心(转速为每分钟12000转)5分钟;将上清液500μl转移至另一离心管中,加入0.1mol/L Tris-盐酸溶液(pH 8.0)500μl,混匀,离心(转速为每分钟12000转)5分钟;将上清液50μl转移至另一离心管中,加入无菌双蒸水450μ1,混匀,作为供试品溶液,置一20℃保存备用。另取金钱白花蛇对照药材0.5g,同法制成对照药材模板DNA溶液。[/font] [b][font=宋体][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]鉴别引物:[/font][font=宋体]5[/font][font=宋体]’[/font][font=宋体]GAAATTTCGGCTCTATGCTTATAACCTGTCTTT3[/font][font=宋体]’和[/font][font=宋体]5[/font][font=宋体]’[/font][font=宋体]GGAATCTTATCGATATCTGAATTAGTA3[/font][font=宋体]’。[/font][font=宋体][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]反应体系:在200μl离心管中进行,反应总体积为25μl,反应体系包括10×[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]缓冲液2.5μl,[color=var(--weui-LINK)]dNTP[i][/i][/color](1Ommol/L)1μl,鉴别引物(10μmol/L)各0.2μl,Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.2μl,模板DNA 1μl,25%聚乙烯吡咯烷酮-40溶液1μl,10mg/ml牛血清蛋白0.5μl,无菌双蒸水18.4μ1。将离心管置[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]仪,[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]反应参数:95℃[color=var(--weui-LINK)]预变性[i][/i][/color]5分钟,循环反应30次(95℃30秒,60℃45秒),延伸(72℃)5分钟。[/font] [b][font=宋体]电泳检测 [/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]照琼脂糖凝胶电泳法(通则0541),胶浓度为1.5%,每100ml胶中加入10000×核酸凝胶染色剂GelRed 5μl;供试品与对照药材[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]反应溶液的上样最分别为5μl,以DL2000(DNA条带从小到大分别为100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp和2000bp)作为DNA分子量标记,进行凝胶电泳检测。电泳结束后,取凝胶片在[color=var(--weui-LINK)]凝胶成像仪[i][/i][/color]上或紫外透射仪上检视。供试品凝胶电泳图谱中,在与对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上,在500~750bp之间应有单一DNA条带,空白对照无条带。[/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font][font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [size=20px][color=#93c6bc][b]浸出物[/b][/color][/size][size=16px][color=#e2a4a4]|[/color][/size] [font=宋体][/font] [b][font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font][/b] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font][font=宋体] 照醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定,用稀乙醇作溶剂,不得少于15.0%。[/font]
在薄层色谱定性时,对照品、供试品和对照药材在相同的问题显相同颜色的斑点即可。对照品和对照药材定性有何区别?为什么两个要同时做呢?
皮刺 皮类药材表面的一种硬而少的突出物,称皮刺,如海桐皮。空泡 药材加工时用火烘烤过快而形成的中心空隙,称空泡。油头 药材根头部偶有黑色发粘的油状物称油头,如川木香。亮星 指药材横切后在阳光下透视,见到的粘液质小点,因能发亮称亮星,如土茯苓。菊花心 指药材横切面上维管束与较窄的射线排列形成细密放射状纹理,状似开放的菊花,称菊花心,如黄芪、甘草。枣皮 指药材果皮皱缩成枣皮状,如山萸肉。珍珠盘 指药材根头部膨大,具有多数隆起的茎基及芽痕,因状似珍珠散于盘中而称珍珠盘,如银柴胡。亮银星 指皮类药材由于表面有结晶析出,置光下显亮银光,如牡丹根皮、厚朴。花白点 指药材断面中心数个散生的放射状木质部黄白相间,与周围形成色彩对比,如胡黄连。通天眼 指羚羊角的神经孔通过角塞顶端的角壳中心,向上呈一扁三角形的小孔直达角尖,习称通天眼。开口子 指青贝药材外层两枚鳞片大小相近,顶端不抱合,俗称开口子。月石坠 指硼砂加工时结在绳子上的干燥结晶,似石坠下,称月石坠。蜘株网纹 措在药材横切面上,木质部大型导管呈针孔状多层整齐排列,与类白色的射线相间而呈蜘蛛网状纹理,如木通等。胶口镜面 指僵蚕药材的断面平坦,外层白色粉性似胶,中间棕黑色发亮似镜。金井玉栏 指根类药材的断面外围白,内心黄,中间有一棕色的形成层环,俗称金井玉栏,如桔梗等。