人凝血酶原复合物国家标准

[align=center][/align][align=left][b] 摘要：目的 [/b]确立不同稀释液对凝血因子效价检测的影响，研究因子效价检测的稀释方法，从而完善因子类血液制品效价检测的方法。 [b]方法 [/b]对同一批和连续生产的10批人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物样品进行全自动血凝仪法的效价检测，分别选用全自动血凝仪稀释液和含1%人血白蛋白稀释液进行检测，统计10次以上的检测结果以确定不同稀释液之间的差别。 [b]结果 [/b]本实验确定了在人凝血因子Ⅷ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ的样品进行稀释，无论是对同一批质控品的测定还是对连续批次样品的测定，检测结果之间存在较大的差别。而在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ的样品进行稀释，同一批质控品和连续批次样品检测结果之间差别较小。[b]结论 [/b]因子类血液制品效价检测时，同一样品采用不同的稀释液进行稀释检测结果可能存在较大差别，应对血凝仪是否可用于因子类血液制品进行评估，并应建立起正确的检测操作规程。[/align][b] 关键词: [/b]凝血因子； 稀释液； 效价测定 目前国内血液制品的生产是以健康人血浆为原料，经过分离纯化和病毒灭活制成，主要分为三大类，人血白蛋白、人免疫球蛋白类产品、人凝血因子类产品。国内已上市或在研的人凝血因子类产品主要有人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人纤维蛋白原、人纤维蛋白粘合剂、人凝血因子Ⅸ、人抗凝血酶Ⅲ等。人凝血因子Ⅷ主要用于防治甲型血友病和获得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血症状病人的手术治疗。人凝血酶原复合物主要有效成分为人凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，主要用于治疗主要用于乙型血友病、 维生素K依赖的凝血因子缺乏症等病症的治疗。 人凝血因子Ⅸ主要用于防治乙型血友病和获得性凝血因子Ⅸ缺乏而致的出血症状病人的手术治疗。因子类血液制品是血液中凝血因子的高纯度浓缩物，在进行效价测定时需要对样品进行稀释，而稀释液中蛋白含量的不同对其检测结果有着影响。因子效价测定方法有一期法、二期法和发色底物法。一期法是目前应用最广泛的检测方法，系用人凝血因子缺乏血浆为基质，在APTT试剂和氯化钙的参与下，根据凝血因子国家标准品和供试品的凝集时间来计算供试品中的人凝血因子效价，实际检测过程中将基于一期法原理的人凝血因子效价测定法分为三种方法，即手工法、半自动血凝仪法、全自动血凝仪法。全自动血凝仪只是对一期法中各反应试剂的加入顺序进行了修订以便实现仪器的自动操作。相对于手工法检测，消除了很多主观因素。在日常工作中，当使用不同种类的稀释剂而采用相同的检测原理和方法进行效价测定应不会对测定结果产生影响，但实际工作中发现使用不同种类的稀释剂对效价测定结果有一定的影响。在人凝血因子Ⅷ效价检测过程中，采用手工法、半自动血凝仪法、全自动血凝仪法进行人凝血因子Ⅷ效价的比对试验，发现手工法、半自动血凝仪法检测结果一致，这两种方法比全自动血凝仪法的检测结果高20%以上。血液制品的原料来源于人血浆，受原料限制，一直较为稀缺，尤其是当前人凝血因子Ⅷ的生产量远远无法满足血友病患者的需求[sup][[/sup][sup]1-5[/sup][sup]][/sup]，不同检测方法间20%以上的检测差别可能影响20%的产品收率，所以建立起因子类产品效价准确的检测至关重要。[b][b]1 实验仪器与试剂1.1 仪器[/b][/b]Stago-compact全自动血凝仪（法国Diagnostica Stago公司），漩涡振荡器（美国Thermo Scientific公司）。[b][b]1.2 试剂[/b][/b]人凝血因子Ⅷ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅸ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），APTT试剂（法国Diagnostica Stago公司），Owren-Koller（稀释液）（法国Diagnostica Stago公司），0.025 mol/L氯化钙溶液（法国Diagnostica Stago公司），Desorb U（清洗液）（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅷ国家标准品（批号20100101），人凝血酶原复合物国家标准品（批号20130306），生理氯化钠溶液（石家庄四药有限公司），咪唑（天津市巴斯夫化工有限公司），氯化钠（天津市巴斯夫化工有限公司），枸橼酸钠（台山新宁制药有限公司），人血白蛋白（公司自产）。[b][b]2 方法2.1 人凝血因子Ⅷ不同稀释液稀释效价测定2.1.1 人凝血因子Ⅷ供试品Owren-Koller（稀释液）稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.1.2 人凝血因子Ⅷ供试品药典稀释液稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标同2.1.1人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.2 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ不同稀释液稀释效价测定2.2.1 人凝血酶原复合物供试品Owren-Koller（稀释液）稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《STAGO Compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]2.2.2 人凝血酶原复合物供试品药典稀释液稀释效价测定方法[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标同2.1.1。人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]3 结果3.1 人凝血因子Ⅷ不同稀释液稀释效价测定结果[/b][/b] 2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ为泰邦公司人凝血因子Ⅷ产品的质控品，取自正常生产的产品，用国家标准品标定后用作工作质控品。在进行人凝血因子Ⅷ效价测定时，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ进行再稀释。检验结果见表1，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表1 FⅧ质控品两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,586,268]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141920_02_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图1：[align=center][img=,488,300]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141921_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图1 FⅧ质控品两种稀释液检测结果对比[/align] 选取泰邦公司生产的连续10个批次的人凝血因子Ⅷ产品，进行人凝血因子Ⅷ效价测定，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ进行再稀释。检验结果见表2，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表2 连续10批FⅧ两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,580,273]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141921_03_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图2：[align=center][img=,499,310]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141922_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图 2 连续10批FⅧ两种稀释液检测结果对比[/align][b][b]3.2 人凝血酶原复合物不同稀释液稀释效价测定结果[/b][/b] 2015ZK0901批人凝血酶原复合物为泰邦公司人凝血酶原复合物产品的质控品，取自正常生产的产品，用国家标准品标定后用作工作质控品。在进行人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定时，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ进行再稀释。检验结果见表3，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表3 PCC质控品两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,580,269]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141923_01_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图3：[align=center][img=,548,288]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141923_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图3 PCC质控品两种稀释液检测结果对比[/align] 选取泰邦公司生产的连续10个批次的人凝血酶原复合物产品，进行人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定，分别用Owren-Koller（稀释液）和药典稀释液（取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血白蛋白至终浓度为1%配制而成）对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ进行再稀释。检验结果见表4，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表4 连续10批PCC两种稀释液检测结果对比[/align][align=center][img=,573,259]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141947_01_1626619_3.png[/img][/align]用柱形图表示，如图4：[align=center][img=,548,327]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709141947_03_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图4 连续10批PCC两种稀释液检测结果对比[/align][b][b]4 讨论[/b][/b] 本实验确定了在人凝血因子Ⅷ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ的样品进行稀释，无论是对同一批质控品的测定还是对连续批次样品的测定，检测结果之间存在较大的差别，另外对FⅧ质控品两种稀释液检测结果运用软件SPSS17.0进行均值单因素ANOVA比较，计算P值，P＜0.05表明两种方法的结果有显著性差异，含有蛋白的稀释液的检测结果明显高于不含蛋白的稀释液。而在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ的效价检测中，采用不同的稀释液对每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ的样品进行稀释，同一批质控品和连续批次样品检测结果之间差别较小，另外对PCC质控品两种稀释液检测结果运用软件SPSS17.0进行均值单因素ANOVA比较，计算P值，P＞0.05表明两种方法的结果无显著性差异。在使用全自动血凝仪进行人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原复合物等因子类血液制品效价检测时，一般按照仪器的使用说明书和配套试剂进行稀释检测，但是忽视了血凝仪的开发目的是用于临床血浆样品的检测，而血浆与高纯度的血液制品浓缩物是不同的，用检测血浆样品的方法进行因子类血液制品的效价检测可能影响检测结果。因子类血液制品效价检测时，同一样品采用不同的稀释液进行稀释检测结果可能存在较大差别，应对血凝仪是否可用于因子类血液制品进行评估，并应建立起正确的检测操作规程。因子类血液制品采用不同的稀释液进行稀释检测结果可能存在较大差别可能跟产品本身的性质有关，因子类血液制品经过分离、纯化，去除了众多的杂质蛋白，为高纯度的浓缩物，活性较高，但蛋白质含量较低，人凝血因子Ⅷ的蛋白质含量约为0.1%，人凝血酶原复合物的蛋白质含量约为2.3%，而临床血浆样本的蛋白质含量约为5%，, 人凝血因子Ⅷ加入含1%人血白蛋白的稀释液后对FⅧ效价测定影响较大，PCC中加入含1%人血白蛋白的稀释液后对FⅨ效价测定影响较小，可能是人凝血因子Ⅷ的蛋白质含量远小于血凝仪设计用于检测的血浆样本的蛋白含量，故建立不同蛋白质浓度梯度的稀释液对因子效价进行测定，从而确认蛋白质浓度对因效价测定的影响。[b]参考文献：[/b]Cheng E, Jinzenji D, Lorthiois AP, et al. Purification of coagulation factorⅧ using chromatographic methods. Direct chromatography of plasma in anion exchange resins . Biotechnol Lett, 2010, 32(9):1207-1214.李策生, 周志军, 胡勇, 等. 人凝血因子Ⅷ中试纯化工艺的质量控制 .中国生物制品学杂志, 2013, 26(10):1508-1512.冉曙光, 刘文芳, 赵辉. 凝血因子Ⅷ浓缩物的制备及安全性和有效性 .中国输血杂志, 2008, 21(2):156-159.倪道明, 朱威. 血液制品 . 北京: 人民卫生出版社, 2013:21.王卓, 赵雄, 吕茂民, 等. 血液制品的现状与展望 . 生物工程学报, 2011, 27(5):730-746.[b] [/b]

[b]中文摘要：目的[/b] 确立因子类血液制品中蛋白质含量对效价检测结果的影响，从而完善因子类血液制品效价检测的方法。[b]方法 [/b]选取不同蛋白质浓度梯度的稀释液对同一供试品进行稀释来确定蛋白质影响的规律。 [b]结果 [/b]建立起人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物的全自动血凝仪因子效价检测方法，根据效价检测反应体系中蛋白浓度对检测结果的影响,建立因子类血液制品效价全自动血凝仪检测的方法。[b]结论 [/b]建立的两种稀释方法均消除了样品中蛋白质含量的不同对检测结果的影响，提高了检测的准确性，不但可以适用于现在产品的效价检测，而且适用于随着生产工艺的提升生产的更高纯度、低蛋白含量的FⅧ和PCC，同时也是对中国药典标准的补充。[b]关键词[/b]：人凝血因子Ⅷ；人凝血酶原复合物；效价；蛋白含量 人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物、人凝血因子Ⅸ等因子类血液制品，是以健康人血浆为原料，经分离纯化和病毒灭活制成，在临床上主要用于各种凝血因子缺乏的治疗，这些因子类血液制品的凝血因子效价是药品有效性的指标，凝血因子效价的测定也是药品质量检测中的关键检测项目。血液制品生产企业及各级检测机构一般采用全自动血凝仪并按照仪器使用说明来进行因子效价的检测，然而在不同检测方法结果比对中，发现全自动血凝仪检测结果与中国药典中一期法的检测结果在部分因子效价检测中存在检测差异，差异可能是样品稀释中使用的稀释液的蛋白含量不同引起的，故本课题主要研究因子类血液制品中蛋白质含量对效价检测结果影响。通过蛋白含量对因子效价检测影响的研究建立起的全自动血凝仪因子效价检测方法，消除了产品本身性质的影响，可以准确进行因子效价的测定，方法的建立不但可以准确控制因子类血液制品的质量，保证生产企业持续稳定生产出质量均一的药品，而且可以减少因子类产品在临床使用中的风险。[b]1 实验仪器与试剂[b]1.1 仪器[/b][/b]Stago-compact全自动血凝仪（法国Diagnostica Stago公司），漩涡振荡器（美国Thermo Scientific公司）。[b][b]1.2 试剂[/b][/b]人凝血因子Ⅷ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅸ缺乏血浆（法国Diagnostica Stago公司），APTT试剂（法国Diagnostica Stago公司），Owren-Koller（稀释液）（法国Diagnostica Stago公司），0.025 mol/L氯化钙溶液（法国Diagnostica Stago公司），Desorb U（清洗液）（法国Diagnostica Stago公司），人凝血因子Ⅷ国家标准品（批号20100101），人凝血酶原复合物国家标准品（批号20130306），生理氯化钠溶液（石家庄四药有限公司），咪唑（天津市巴斯夫化工有限公司），氯化钠（天津市巴斯夫化工有限公司），枸橼酸钠（台山新宁制药有限公司），人血白蛋白（公司自产）。[b][b]2 方法2.1 人凝血因子Ⅷ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定[/b][/b] 人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 不同蛋白质浓度梯度稀释液制备：选取全自动血凝仪的稀释液Owren-Koller、生理氯化钠溶液、取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合液分别定义为稀释液1、稀释液2、稀释液3。向3种稀释液中分别加入人血白蛋白，使其中人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%。 人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用含不同蛋白浓度的稀释液做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.2 人凝血因子Ⅷ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定[/b] [/b]人凝血因子Ⅷ国家标准品的定标：取1支人凝血因子Ⅷ国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其稀释成每1ml含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅷ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅷ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅷ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅷ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅷ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 人凝血因子Ⅷ供试品效价测定：取人凝血因子Ⅷ供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅷ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅷ效价测定选项进行测定。[b][b]2.3 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 不同蛋白质浓度梯度稀释液制备同2.1。 人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用生理氯化钠溶液将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用含不同蛋白浓度的稀释液做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]2.4 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定[/b][/b] 人凝血因子Ⅸ国家标准品的定标：取1支人凝血酶原复合物国家标准品，加入1.0 ml纯化水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其稀释成每1 ml含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，将Desorb U（清洗液）、复溶后的人凝血因子Ⅸ缺乏血浆、0.025 mol/L氯化钙溶液、APTT以及每1 ml含1.00 IU的人凝血因子Ⅸ标准品溶液分别装入全自动血凝仪的试剂抽屉，将Owren-Koller（稀释液）装入全自动血凝仪的样本抽屉，按照《Stago-compact全自动血凝仪标准操作规程》选择人凝血因子Ⅸ效价测定定标程序进行定标，仪器自动将装入的人凝血因子Ⅸ标准品溶液再进行2倍、4倍、8倍稀释，建立人凝血因子Ⅸ标准品溶液效价（分别为1.00 IU/ml、0.50 IU/ml、0.25 IU/ml、0.13 IU/ml）的对数对其相应凝固时间对数的直线回归方程。 人凝血酶原复合物供试品效价测定：取人凝血酶原复合物供试品，按其标示装量加入灭菌注射用水复溶，轻轻混匀，用人凝血因子Ⅸ缺乏血浆将其稀释成每1 ml约含1.00 IU人凝血因子Ⅸ，再用Owren-Koller（稀释液）做2倍、4倍稀释，将稀释后的供试品溶液装入全自动血凝仪的样本抽屉，选择人凝血因子Ⅸ效价测定选项进行测定。[b][b]3 结果3.1 人凝血因子Ⅷ不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定结果[/b][/b] 选取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ进行了不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定，不同浓度稀释液分别测定10次。人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果分别见表1、2、3，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表1 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液1检测结果[/align][align=center][img=,590,266]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142017_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表2 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液2检测结果 [/align][align=center][img=,586,260]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142019_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表3 FⅧ质控品不同蛋白浓度梯度稀释液3检测结果 [/align][align=center][img=,585,261]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142019_02_1626619_3.png[/img][/align]人凝血因子Ⅷ质控品2015ZK0801批用不同蛋白质浓度梯度的稀释液1、稀释液2、稀释液3稀释效价检测结果平均值用折线图表示，如图1：[align=center]图1 FⅧ质控品不同蛋白质浓度检测结果对比[/align][align=center][img=,548,295]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142019_03_1626619_3.png[/img][/align] 选取2批国外产人凝血因子Ⅷ和VWF混合制剂进行了不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定，人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、3%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果见表4、5，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表4 658668A批制剂FⅧ检测结果[/align][align=center][img=,585,99]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142020_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表5 A3B1814批制剂FⅧ检测结果[/align][align=center][img=,577,97]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142021_01_1626619_3.png[/img][/align]FⅧ效价检测结果用折线图表示，如图2、3：[align=center][img=,563,299]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142029_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图2 658668A批不同蛋白质浓度检测结果对比[/align][align=center][img=,567,287]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142030_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图3 A3B1814批不同蛋白质浓度检测结果对比[/align][b][b]3.2 人凝血酶原复合物不同蛋白质浓度梯度稀释效价测定结果[/b][/b] 选取2015ZK0901批人凝血酶原复合物进行了不同蛋白质浓度梯度稀释人凝血因子Ⅸ效价测定，不同浓度稀释液分别测定10次。人血白蛋白的浓度分别为0、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的稀释液1、稀释液2、稀释液3的效价检测结果分别见表6、7、8，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表6 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液1检测结果[/align][align=center][img=,583,269]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142031_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表7 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液2检测结果[/align][align=center][img=,586,260]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142031_02_1626619_3.png[/img][/align][align=center]表8 PCC质控品不同蛋白浓度梯度稀释液3检测结果[/align][align=center][img=,593,263]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142043_01_1626619_3.png[/img][/align]人凝血酶原复合物质控品2015ZK0901批用不同蛋白质浓度梯度的稀释液1、稀释液2、稀释液3稀释FⅨ效价检测结果平均值用折线图表示，如图4：[align=center][img=,556,300]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142032_01_1626619_3.png[/img][/align][align=center]图4 PCC质控品不同蛋白质浓度FⅨ检测结果对比[/align][b][b]3.3 人凝血因子Ⅷ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定结果[/b][/b]选取2015ZK0801批人凝血因子Ⅷ进行了人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定，共测定10次。效价检测结果见表9，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表9 FⅧ质控品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果[/align][align=center][img=,579,74]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142032_02_1626619_3.png[/img][/align]选取2批国外产人凝血因子Ⅷ和VWF混合制剂进行了人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定。效价检测结果见表10，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表10 国外产品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果[/align][align=center][img=,578,77]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142036_01_1626619_3.png[/img][/align][b][b]3.4 人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定结果[/b][/b]选取2015ZK0901批人凝血酶原复合物进行了人凝血因子缺乏血浆稀释人凝血因子Ⅸ效价测定，共测定10次。效价检测结果见表11，效价检测结果为效价标示量的百分比。[align=center]表11 PCC质控品人凝血因子缺乏血浆稀释检测结果[/align][align=center][img=,582,89]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2017/09/201709142047_01_1626619_3.png[/img][/align][b][b]4 讨论[/b][/b] 本实验中对人凝血因子Ⅷ和人凝血酶原复合物分别用不同蛋白浓度梯度的稀释液进行了效价测定，另外用人凝血因子缺乏血浆稀释后进行了效价测定。因子效价测定中，稀释液1、稀释液2、稀释液3中加入相同浓度的人血白蛋白后，得到的因子效价检测结果没有差异，说明全自动血凝仪的稀释液Owren-Koller、生理氯化钠溶液、取1体积的3.8%枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合液作为稀释液时没有区别。 人凝血因子Ⅷ、人凝血酶原复合物不同蛋白浓度梯度效价测定时，随着稀释液中蛋白质含量的增高，效价检测结果也不断升高，但在人凝血因子Ⅷ效价测定中，采用蛋白质含量为1%、3%的稀释液时，效价检测结果间均无显著差别，在人凝血酶原复合物人凝血因子Ⅸ效价测定中，采用蛋白质含量为0、0.5%、1%的稀释液时，效价检测结果间均无显著差别。另外，人凝血因子Ⅷ进行人凝血因子缺乏血浆稀释效价测定效价检测结果与采用蛋白质含量为1%、3%的稀释液得到的检测结果也无显著差异，人凝血酶原复合物人凝血因子缺乏血浆稀释人凝血因子Ⅸ效价检测结果与采用蛋白质含量为0、0.5%、1%的稀释液得到的检测结果也无显著差异。另外，国外生产的人凝血因子Ⅷ和VWF的混合制剂FⅧ效价的检测结果及血浆、稀释液的影响同泰邦公司产品一致。[b]参考文献[/b][align=left] 邬杨斌, 余蓉. 凝血因子Ⅸ复合物的研制 . 华西药学杂志, 2000, 15(3):177-179. Pabinger I, Brenner B, Kalina U, et al. Prothrombin complex concentrate（Beriplexw P/N）for emergency anticoagulation reversal: A prospective multinational clinical trial . J Thromb Haemost, 2008, 6(4):622-631. Kiman E, Elela AA, Ｒamsis N, et al. Evaluation of the coagulation factors activity of Cryosupernatant . Suez Canal Univ Med J, 2003, 6(2):247-258.Tullis JL, Melin M, Jurigian P. Clinical use of human Prothrombin complexes . N Engl J Med, 1965, 73(13):667-674.马莉, 孙盼, 李长清, 等. 去冷沉淀血浆的质量分析 . 中国生物制品学杂志, 2013, 26(1):81-83.魏舒, 时凯, 刘国荣, 等. 冻干人凝血酶原复合物的生产工艺研究 . 中国输血杂志, 2008, 21(10):282-284.Samama CM. Prothrombin complex concentrates: a brief review . Eur J Anaesthesiol, 2008, 25(10):784-789.焦丽华, 代旭兰, 刘文芳. 凝血酶原复合物的制备及其临床应用进展 .中国输血杂志, 2008, 21(9):737-741.[/align][b] [/b]