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请教各位老师,从一个资料上看说乳糖蛋白胨中的乳糖不能换成葡萄糖是因为葡萄糖经发酵产酸过多使PH达到4.5,使大肠杆菌死亡!这个说法对吗?还有大肠菌群的生长ph范围是多少。有根据吗?
很多朋友问这样一个问题:为什么毕赤酵母表达困难?他们自己也很纳闷,重组酵母pcr检测也证明目的基因重组了,但是诱导之后就是在表达上清中检测不到目的蛋白,仔细研究操作手册后仍然不知道原因。本人,根据自己的经验,采用倒推的方法,按实验过程从后向前分析,供大家参考:1、诱导之后表达上清中检测不到目的蛋白:分析1:检测的方法是否有问题,要考虑是不是蛋白表达量低而没有检测到? 如果是蛋白表达低,可以选择浓缩蛋白,具体的方法很多,有TCA、丙酮、浓缩柱等等方法,之前在本版已经发过帖,在此不赘述。 2、如果蛋白浓缩N倍之后仍然检测不到,那基本可以确证蛋白并不在上清中。那么蛋白到哪里去了,考虑是否没有分泌出来,而是在胞内,那就需要通过裂解酵母来检 测胞内蛋白,具体的方法很多,在此也不赘述,曾整理过相关破碎的帖子。 3、如果胞内也没有目的蛋白表达,那么基本可以确定蛋白并没有表达。 4、为什么没有表达呢?倒推回来就是诱导的过程了,诱导体系是什么?甲醇浓度是多少?培养问题是多少,转速是多少?这些都要注意。甲醇一般是0.5%-1.0%,本人用的 是0.5%,也有很多人也用1.0%,曾见过一个帖子,说超过1.5%反而会抑制表达,没有验证过,供大家参考。培养问题28-30度比较合适,转速250rpm比较合适,诱导 体系没有固定的体系,说明书上推荐的是BMGY到OD600 2~6,换到BMMY中OD600 为1左右。 5、如果诱导的过程也没有问题,那问题就复杂了,特别是重组酵母PCR检测证明目的基因确实已经发生了重组。这个时候是最郁闷的了,但是郁闷怎么办,还是要找原 因,在此我给的建议是先做RT-PCR证明mRNA水平的情况,也就是说有没有转录。如果转录了,后续的操作也没有问题(本帖的1、2、3、4项),那么只有重新设计实 验,比如换酵母株,有文章上说:用GS115表达不出蛋白,换KM71H后,大部分克隆能表达。 6、有个帖子说的很好,在此和大家分享一下。 1、 菌株:用GS115表达不出蛋白,换KM71H后,大部分克隆能表达。 2、温度: 在28度和室温下诱导表达,表达水平可能都不低。 3、pH:手册上用6.0,pH提高到6.8,不表达的蛋白可能就表达出来。BMMY的pH7.0-7.5比较合适。国内外做的最好的rHSA,最适pH大概5-6左右。pH3的时 候yeast和peptone好像会沉淀的,可以用磷酸和磷酸二氢钾调,具体比例自己去试试。 4、偏爱密码子: codon bias一般不是主要的问题,你要表达的蛋白特性才是主要问题,酵母对分子量大(30KD以上),结构复杂(如一些蛋白酶),二硫键含量多的 蛋白往往不能有效表达,尤其是分泌表达。密码子改造对一些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。比如一位战友用Pichia酵母表达一个单链 抗体,29KD,含有2对二硫键,表达量约几毫克每升,选用酵母偏好密码子全基因合成后,表达量没有什么提高。 5、表达时间与空质粒转化对照:诱导时间长了以后,是会有很多蛋白分泌出来的,时间越长杂蛋白就越多,且分子量都比较大。最好做一个空质粒转化的对照, 这样就会比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。 6、污染:每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌(30ml玻璃管,比LB管大一点),纱布一般用8层,一天左右看着比较浑离心,留样1ml,余 1ml换2ml BMMY诱导表达,3,4层纱布足够了。 污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的,只盖纱布肯定会污染。加盖报纸后,就再没遇到过污染。如果只用6层纱布,污染的可能当然很大,100ml三角瓶, 装量10ml培养液,用橡筋把8层纱布和2层报纸拴紧封口,空气浴摇床。 7、不表达:蛋白有没有表达就要看你的运气了,一般重复2-3次实验都没有表达菌株,这个蛋白就放弃表达了。 8、表达量: 30KD,10mg/L表达量已经很高,最直接的方法是发酵,一般提高5-10倍。大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。 9、糖基化:酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的,有如下序列:N X S/T就是潜在的糖基化位点,X为任意氨基酸,1个糖基化位点会加上1-3KD左右的糖基。另外可 能还有O糖基化话,但是无法预测其位点,不过很少听说表达蛋白有O糖基化的。如果胞内表达,不存在糖基化的问题。 10、表型与表达:重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换,结果就是产生Mut+和Muts表型的菌株;前者在甲醇诱导表达时生长快,消耗的甲醇多,后者生长慢,消耗 的甲醇少,所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。一般用Mut+表型的较多,但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好,只有试试才知道你的蛋白用那种菌 株表达较好。 11、培养基 YPD:最基本的培养用;BMGY:诱导表达前培养用;BMMY:诱导表达用;MD:电转化后筛选his+用。 YEPD是不能代替BMGY的,因为有葡萄糖,这样残留的葡萄糖会影响下一步的诱导表达。不过有一种方法是可行的,就是用YPG培养基代替,只是把YEPD中的葡萄糖 用3%的甘油代替,也可以降低成本。摇瓶毕竟不能和发酵罐比,甘油残余会抑制甲醇利用。 BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇,在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。 YNB可以高压灭菌,没问题的,也可以0.22um过滤处理,天冬氨酸和苏氨酸要待培养基高压灭菌后加入;配YPD时可以加入YPD一起灭菌,但时间不能太长,温度不能 太高,一般121-125度12-15分钟足够了。若时间过长,温度过高,可能导致YPD焦化。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应,这是配制培养基中的禁忌。 颜色很深的话,基本不能使用了。或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压灭菌。 小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除,培养基价格便宜,操作又方便,可以直接灭菌,效果也很好(效果不比含YNB的差)。 如果是用自己配置的培养基,如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提液等等,可以不用换液,采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。 用无机盐进行大规模发酵,更省钱。更多有关蛋白表达纯化的相关资料,请点击:资料专区
本文引用自cheney《蛋白胨和胰蛋白胨简介》蛋白胨是将肉、酪素或明胶用酸或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂,具有肉香的特殊气息。蛋白质经酸、碱或蛋白酶分解后也可形成蛋白胨。蛋白胨富含有机氮化合物,也含有一些维生素和糖类。它可以作为微生物培养基的主要原料,在抗生素、医药工业、发酵工业、生化制品及微生物学科研等领域中的用量均很大。不同的生物体需要特定的氨基酸和多肽,因此存在着各种蛋白胨,一般来说,用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白(酪蛋白、肉类)和植物蛋白(豆类)等两种。能为微生物提供C源、N源、生长因子等营养物质。因此,蛋白胨从来源上可分为动物性蛋白胨和植物性蛋白胨。胰胨、肉胨、骨胨等都是动物性蛋白胨,而大豆蛋白胨等则是植物性蛋白胨。动物性来源的蛋白胨还有:蚕蛹蛋白胨、血液蛋白胨等。 不同来源的蛋白质和不同的水解条件,其水解物中组成可千差万别。所以胨往往是一个复杂的多肽混合物。可溶于水,过热不凝固,在饱和硫酸铵中不发生沉淀但可为蛋白质沉淀剂所沉淀。可用作微生物和动物细胞培养基、特种功能性食品和化妆品的配料,也有用作啤酒等产品的稳定剂。胰蛋白胨,又称胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)、胰酶消化酪蛋白胨(Pancreatic digest of casein),是一种优质蛋白胨,是以新鲜牛肉和牛骨经胰酶消化,浓缩干燥而成的浅黄色粉末。具有色浅、易溶、透明、无沉淀等良好的物理性状。含有丰富的氮源、氨基酸等,可配制各种微生物培养基,用于细菌的培养、分离、增殖、鉴定,以及无菌试验培养基、厌氧菌培养基等细菌生化特性试验用培养基的配置。胰蛋白胨还广泛应用于高品质的抗生素、维生素、医药工业,氨基酸、有机酸、酶制剂、黄原胶等发酵工业,生化制品及微生物学科研等领域中的用量均很大,临床用于抗炎消肿,工业上用于皮革制造,生丝处理,食品加工。在国际市场上,胰蛋白胨也属于货紧价昂的短线品种之一。 胰酪蛋白胨质量标准及其检验标准: 常规各项理化指标: 1. 澄清度(磷酸盐、碱性沉淀):无沉淀、澄清 2. 2%水溶液:透明 3. 酸碱度:6-7 4. 氨基氮:≥3% 5. 色氨酸:≥0.8% 6. 胨含量:≥80% 7. 总氮:≥13% 8. 水份:≤5% 9. 灰份:≤6% 10. 氯化钠:≤0.2%胰蛋白胨特指用胰蛋白酶酶解酪蛋白生成的蛋白胨产物,与一般蛋白胨的区别在于酶解工艺处理上,属于水解度更高、胨分子量更小更均衡的蛋白胨。