甲醇中赭曲霉毒素溶液标准

赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素。现已发现有7种曲霉和6种青霉菌能产生赭曲霉毒素A。该毒素主要污染粮谷类农产品如燕麦、大麦、小麦、玉米、动物饲料和动物性食品(如猪肾脏、肝脏)等。赭曲霉毒素主要侵害动物肝脏与肾脏。这种毒素主要是引起肾脏损伤，大量的毒素也可能引起动物的肠黏膜炎症和坏死。还在动物试验中观察到它的致畸作用。其中，赭曲霉毒素的毒性强弱顺序是：OTAOTCOTB，本实验主要针对小麦粉中赭曲霉毒素A的测定。[align=center][img=,473,387]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910101354410395_842_932_3.jpg!w473x387.jpg[/img][/align][align=center]赭曲霉毒素[/align][b]参考标准[/b]《GB 5009.96-2016 食品安全国家标准 食品中赭曲霉毒素A的测定》第一法[b]实验步骤[/b]甲醇-水（80:20）：80mL甲醇+20mL水，混匀磷酸缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾溶解于约990mL水中，用浓盐酸调节pH至7.0，用水稀释至1L[b]（1）样品提取[/b]称取5g小麦粉试样于50mL离心管中，加20mL甲醇水（80：20）混合溶液，震荡30min：8000r/min离心3min， 移去10mL上清液，加入磷酸缓冲溶液40mL，经过8000r/min离心3min备用。[b]（2）样品净化[/b]活化：将赭曲霉毒素A免疫亲和柱放置到室温，然后接上注射器上样：将上述提取液全部转移到注射器上，以1滴/s的速度通过免疫亲和柱，弃流出液淋洗：先用10mL磷酸缓冲溶液淋洗，再用10mL水淋洗，然后将小柱抽干洗脱：准确加入1mL甲醇洗脱至进样瓶中，抽干，待HPLC分析。[b]（3）仪器条件[/b]HPLC条件色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18 4.6×150mm，5μm仪器型号：waters2695+FLR2475流动相：A:2%冰乙酸水溶液 B：乙腈 等度洗脱：A：B(50：50)柱温：35℃流速：1.0mL/min检测波长：激发波长333nm 发射波长 460nm 进样体积：10μL[b]（4）实验图谱及结果[/b][align=center][img=,600,480]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910101354467891_1843_932_3.jpg!w640x513.jpg[/img][/align][align=center]图1 赭曲霉毒素A样品加标1μg/kg液相色谱图[/align][align=center][img=,600,482]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910101354514477_6243_932_3.png!w640x515.jpg[/img][/align][align=center]图2 赭曲霉毒素A样品加标2μg/kg液相色谱色谱图[/align][align=left]由表1可知，采用免疫亲和柱结合液相色谱法检测赭曲霉毒素A，加标量为1μg/kg和2.0μg/kg的样品进行了检测，回收率在85.33%~101.94%，能够满足检测要求。由图1可看出经赭曲霉毒素A免疫亲和柱净化，采用月旭Xtimate C18色谱柱检测峰形良好，保留时间稳定。[/align][align=left][/align][align=center][img=,600,86]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/10/201910101354562430_2197_932_3.jpg!w593x85.jpg[/img][/align][align=center]表1 赭曲霉毒素A加标回收实验结果(n=6)[/align][b]（5）实际样品检测[/b]为了保证小麦粉样品的代表性，从多家超市以及菜场选择具有代表性的10个小麦粉样品进行检测，结果均为未检出。[b]（6）结论[/b]本实验建立了赭曲霉毒素A检测的HPLC检测方法，对于加标量为1.0和2.0μg/kg的样品进行了检测，回收率在85.33%~101.94%，符合国标要求，免疫亲和柱方法稳定并且色谱柱重现性良好，说明本方法能够用于检测食品中的赭曲霉毒素A的含量。[b]（7）订购指南[/b] [table=825][tr][td=1,1,114][b]订货号[/b][/td][td=1,1,221][b]产品名称[/b][/td][td=1,1,490][b]包装规格[/b][/td][/tr][tr][td]01140-06032[/td][td]Welchrom 赭曲霉毒素免疫亲和柱[/td][td]3mL，15支[/td][/tr][tr][td]00207-31041[/td][td]Ultimate AQ-C18[/td][td]5.0μm，4.6×150mm[/td][/tr][tr][td]031888-07[/td][td]赭曲霉毒素A标准品[/td][td]CAS No.:303-47-9，10 mg/l于乙腈：甲醇=1：1，1ml[/td][/tr][tr][td]00000-30016[/td][td]50mL螺口尖底离心管[/td][td]50支/包[/td][/tr][tr][td]00824-31001[/td][td]Welch 固相萃取装置[/td][td]12位方缸[/td][/tr][tr][td]WEL-REX-25A[/td][td]固相萃取配套真空泵[/td][td]抽气流量：25L/min[/td][/tr][tr][td]00802-02201[/td][td]针头式过滤器 Nylon[/td][td]13*0.22 100pk[/td][/tr][tr][td]00824-11101[/td][td]一次性注射器[/td][td]200pk/盒 带针头 橡胶头 1ml[/td][/tr][tr][td]00821-32291[/td][td]盖子+垫片[/td][td]预切口红色特氟龙/白色硅胶隔垫，9mm蓝色短螺纹开口盖 中心孔6mm 100pk[/td][/tr][tr][td]00821-40927[/td][td]样品瓶[/td][td]2ml 透明短螺纹广口样品瓶 带书写处 11.6*32mm 一级水解玻璃 100pk[/td][/tr][tr][td]00814-01010[/td][td]乙腈-HPLC级[/td][td]4L[/td][/tr][tr][td]00814-01008[/td][td]甲醇-HPLC级[/td][td]4L[/td][/tr][/table][align=center][/align][align=center][/align]

[align=center][b]食品中赭曲霉毒素A的测定[/b][/align][align=center][b]离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法[/b][/align][align=left][b][b]1 范围[/b][/b][/align][align=left][b]本方法研究了食品中赭曲霉毒素A的测定方法,适用于玉米、稻谷(糙米)、小麦、小麦粉、大豆、咖啡、葡萄酒中赭曲霉毒素 A 的测定。[/b][/align][b][/b][align=left][b][b]2 规范性引用文件[/b][/b][/align][align=left][b]GB 5009.96—2016 食品中赭曲霉毒素 A的测定 第二法 离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法。[/b][/align][b][/b][align=left][b][b]3 原理[/b][/b][/align][align=left][b] 用提取液提取试样中的赭曲霉毒素 A,经离子交换固相萃取柱净化后,采用高效液相色谱仪结合荧光检测器测定赭曲霉毒素 A 的含量,外标法定量。[/b][/align][b][/b][align=left][b][b]4仪器设备和试剂材料[/b][/b][/align][align=left][b][b]4.1 仪器设备[/b][/b][/align][align=left][b]4.1.1 高效液相色谱仪配荧光检测器。[/b][/align][align=left][b]4.1.2 分析天平:感量0.01g和0.0001g。[/b][/align][align=left][b]4.1.3 固相萃取柱:高分子聚合物基质阴离子交换固相萃取柱,柱规格3 mL,柱床重量200 mg,或等效柱。[/b][/align][align=left][b]4.1.4 氮吹仪。[/b][/align][align=left][b]4.1.5 涡旋振荡器。[/b][/align][align=left][b]4.1.6 旋转蒸发仪。[/b][/align][align=left][b]4.1.7 高速万能粉碎机:≥12000r/min。[/b][/align][align=left][b]4.1.8 20目标准筛。[/b][/align][align=left][b]4.1.9 有机滤膜:孔径0.45μm和[b]0.22μm[/b]。[/b][/align][align=left][b]4.1.10 快速定性滤纸[/b][/align][b][/b][align=left][b][b]4.2试剂和材料[/b][/b][/align][align=left][b]除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为一级水。[/b][/align][align=left][b]4.2.1 乙腈(CH3CN):色谱纯。[/b][/align][align=left][b]4.2.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。[/b][/align][align=left][b]4.2.3 冰乙酸(C2H4O2)。[/b][/align][align=left][b]4.2.4 石油醚:分析纯,60 ℃~90 ℃。[/b][/align][align=left][b]4.2.5 甲酸(CH2O2)。[/b][/align][align=left][b]4.2.6 三氯甲烷(CHCl3)。[/b][/align][align=left][b]4.2.7 碳酸氢钠(NaHCO3)。[/b][/align][align=left][b]4.2.8 磷酸(H3PO4)。[/b][/align][align=left][b]4.2.9 氢氧化钾(KOH)。[/b][/align][align=left][b]4.2.10 氢氧化钾溶液(0.1mol/L):称取氢氧化钾0.56g,溶于100mL水。[/b][/align][align=left][b]4.2.11 磷酸水溶液(0.1mol/L):移取0.68mL磷酸,溶于100mL水。[/b][/align][align=left][b]4.2.12 碳酸氢钠溶液(30g/L):称取碳酸氢钠30.0g,溶于1000mL水。[/b][/align][align=left][b]4.2.13乙酸水溶液(2%):移取20mL冰乙酸,溶于980mL水。[/b][/align][align=left][b]4.2.14 提取液:氢氧化钾溶液(0.1mol/L)-甲醇-水(2+60+38)。[/b][/align][align=left][b]4.2.15 淋洗液:氢氧化钾溶液(0.1mol/L)-乙腈-水(3+50+47)。[/b][/align][align=left][b]4.2.16 洗脱液:甲醇-乙腈-甲酸-水(40+50+5+5)。[/b][/align][align=left][b]4.2.17 甲醇-碳酸氢钠溶液(30g/L)(50+50)。[/b][/align][align=left][b]4.2.18 乙腈-2%乙酸水溶液(50+50)。[/b][/align][align=left][b]4.2.19 标准品赭曲霉毒素 A(C20H18ClNO6,CAS号:303-47-9),纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。[/b][/align][align=left][b]4.2.20 标准溶液配制[/b][/align][align=left][b]4.2.20.1赭曲霉毒素 A标准储备液:准确称取一定量的赭曲霉毒素A标准品,用甲醇溶解配 制成100μg/mL的标准储备液,于-20 ℃避光保存。[/b][/align][align=left][b]4.2.20.2 赭曲霉毒素 A 标准工作液:准确移取一定量的赭曲霉毒素 A 标准储备液,用甲醇溶解配制成1μg/mL的标准储备液,于4 ℃避光保存。[/b][/align][align=left][b]4.2.20.3 赭曲霉毒素 A 系列标准工作液:准确移取适量赭曲霉毒素 A 标准工作液,用甲醇稀释配制成1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL的系列标准工作曲线。[/b][/align][b][/b][align=left][b][b]5 分析步骤[/b][/b][/align][align=left][b][b]5.1 试样制备及前处理[/b][/b][/align][align=left][b]5.1.1 玉米[/b][/align][align=left][b]称取试样10.0g(精确至0.01g),加入50mL三氯甲烷和5mL0.1mol/L的磷酸水溶液,于涡旋振荡器上振荡提取3min~5min,提取液用定性滤纸过滤,取10mL下层滤液至100mL平底烧瓶中,于40℃水浴中用旋转蒸发仪旋转蒸发至近干,用20mL石油醚溶解残渣后加入10mL提取液,再用涡旋振荡器振荡提取3 min~5 min,静置分层后取下层溶液,用滤纸过滤,取5 mL 滤液进行固相萃取净化。[/b][/align][align=left][b]5.1.2稻谷(糙米)、小麦、小麦粉、大豆[/b][/align][align=left][b]称取试样10.0g(精确至0.01g),加入50mL提取液,于涡旋振荡器上振荡提取3min~5min,用定性滤纸过滤,取10mL滤液至100mL平底烧瓶中,加入20mL石油醚,涡旋振荡器振荡提取3min~5min,静置分层后取下层溶液,用滤纸过滤,取5mL滤液进行固相萃取净化。[/b][/align][align=left][b]5.1.3咖啡[/b][/align][align=left][b]称取试样2.5g(精确至0.01g)于50mL聚丙烯锥形试管(带盖)中,加入25mL甲醇-碳酸氢钠溶液于涡旋振荡器振荡提取3min~5min,4000r/min离心10min后上清液用滤纸过滤,取10mL滤液进行固相萃取净化。[/b][/align][align=left][b]5.1.4葡萄酒[/b][/align][align=left][b]移取试样10.0g(精确至0.01g)于烧杯中,加入6mL 提取液,混匀,再用氢氧化钾溶液调 pH 至[/b][/align][align=left][b]9.0~10.0 进行固相萃取净化。[/b][/align][align=left][b]5.1.5试样净化[/b][/align][align=left][b]分别用5mL甲醇、3mL提取液活化固相萃取柱,然后将12.2制备的样品提取液加入固相萃取柱,调节流速以1滴/s~2滴/s的速度通过柱子,分别依次用3mL淋洗液、3mL水、3mL甲醇淋洗柱,抽干,用5mL洗脱液洗脱,收集洗脱液于玻璃试管中,于45℃下氮气吹干,用1mL乙腈-2%乙酸水溶液溶解,过滤后备用。[/b][/align][b][/b][align=left][b][b]5.2 仪器参考条件[/b][/b][/align][align=left][b]a) 色谱柱:C18柱,柱长50mm,内径2.1mm,粒径 1.7um 或等效柱 [/b][/align][align=left][b]b) 柱温:30 ℃ [/b][/align][align=left][b]c) 进样量:2μL [/b][/align][align=left][b]d) 流速:0.2mL/min [/b][/align][align=left][b]e) 检测波长:激发波长:333nm,发射波长:460nm [/b][/align][align=left][b]f) 流动相及洗脱条件:[/b][/align][align=left][b]流动相:A:冰乙酸-水(2+100),B:乙腈 [/b][/align][align=left][b]等度洗脱条件:A-B(50+50) 梯度洗脱条件:见表1。[/b][/align][align=left][b]表 1 流动相及梯度洗脱[/b][/align][align=left][b][/b][/align][b][/b][align=left][b] [/b][/align][table][tr][td]时间/min[/td][td]流动相A/%[/td][td]流动相B/%[/td][/tr][tr][td]0[/td][td]88[/td][td]12[/td][/tr][tr][td]1[/td][td]88[/td][td]12[/td][/tr][tr][td]4[/td][td]70[/td][td]30[/td][/tr][tr][td]6[/td][td]50[/td][td]50[/td][/tr][tr][td]10[/td][td]50[/td][td]50[/td][/tr][tr][td]10.1[/td][td]0[/td][td]100[/td][/tr][tr][td]12[/td][td]0[/td][td]100[/td][/tr][tr][td]12.1[/td][td]88[/td][td]12[/td][/tr][tr][td]17[/td][td]88[/td][td]12[/td][/tr][/table][align=left][/align][align=left][/align][b][/b][align=left][b]6.色谱测定[/b][/align][align=left][b]在色谱条件下,将赭曲霉毒素 A 标准工作溶液按浓度从低到高依次注入高效液相色谱仪 待仪器条件稳定后,以目标物质的浓度为横坐标(x 轴),目标物质的峰面积为纵坐标(y 轴),对各个数据点进行最小二乘线性拟合,标准工作曲线按式计算[/b][/align][align=left][b]y =ax+b[/b][/align][align=left][b]式中:[/b][/align][align=left][b]y ———目标物质的峰面积 [/b][/align][align=left][b]a ———回归曲线的斜率 [/b][/align][align=left][b]x ———目标物质的浓度 [/b][/align][align=left][b]b ———回归曲线的截距。[/b][/align][align=left][b]注:咖啡和葡萄酒样品测定采用梯度洗脱程序,其他样品采用等度洗脱程序。[/b][/align][align=center][b]赭曲霉毒素A标准色谱图[/b][/align][align=center][b][img=,677,336]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807021619108898_2666_1628367_3.png!w677x336.jpg[/img][/b][/align][align=center][b][/b][/align][align=center][b]赭曲霉毒素A标准曲线和校正表[/b][/align][img=,663,596]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807021619384057_2057_1628367_3.png!w663x596.jpg[/img][align=center][b][img=,690,270]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/07/201807021625519606_1437_1628367_3.jpg!w690x270.jpg[/img][/b][/align][align=center][b]7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。[/b][/align][align=left][b]表1 回收率实验结果[/b][/align][align=left][b][/b][/align][b] [/b][table][tr][td] [align=center]组份[/align] [/td][td] [align=center]加标水平（ng/ml）[/align] [/td][td] [align=center][color=black]测定值（[/color][color=black]ng/mL[/color][color=black]）[/color][/align] [/td][td] [align=center]回收率（%）[/align] [/td][/tr][tr][td=1,6] [align=center]赭曲霉毒素A[/align] [/td][td] [align=center]1.026[/align] [/td][td] [align=center]1.301[/align] [/td][td] [align=center][color=black]126.8%[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1.026[/align] [/td][td] [align=center]0.937[/align] [/td][td] [align=center][color=black]91.3%[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5.13[/align] [/td][td] [align=center]6.216[/align] [/td][td] [align=center][color=black]121.2%[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5.13[/align] [/td][td] [align=center]6.320[/align] [/td][td] [align=center]123.2%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]51.3[/align] [/td][td] [align=center]53.718[/align] [/td][td] [align=center]104.7%[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]51.3[/align] [/td][td] [align=center]48.708[/align] [/td][td] [align=center]94.9%[/align] [/td][/tr][/table][align=left][/align][align=left][b]表2 精密度实验结果[/b][/align][b] [/b][table][tr][td=1,2] 组分次数[/td][td=2,1] [align=center]赭曲霉毒素A[/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center][color=black]保留时间（[/color][color=black]min[/color][color=black]）[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=black]面积[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]1[/align] [/td][td] [align=center][color=black]9.241[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=black]165638[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]2[/align] [/td][td] [align=center]9.224[/align] [/td][td] [align=center][color=black]167581[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]3[/align] [/td][td] [align=center]9.235[/align] [/td][td] [align=center][color=black]168412[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]4[/align] [/td][td] [align=center]9.244[/align] [/td][td] [align=center][color=black]166277[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]5[/align] [/td][td] [align=center]9.234[/align] [/td][td] [align=center][color=black]168061[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]6[/align] [/td][td] [align=center]9.231[/align] [/td][td] [align=center][color=black]165367[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]7[/align] [/td][td] [align=center]9.235[/align] [/td][td] [align=center][color=black]166159[/color][/align] [/td][/tr][tr][td] [align=center]RSD%[/align] [/td][td] [align=center][color=black]0.1[/color][/align] [/td][td] [align=center][color=black]0.7[/color][/align] [/td][/tr][/table][align=left][/align]