人分泌型磷脂酶

加拿大发布允许食品中使用菌黑曲霉派生磷脂酶A2的临时营销售批准来源：厦门WTO工作站 2009年10月21日，加拿大发布G/SPS/N/CAN/399号通报，加拿大卫生署拟制定有关用于生产面包、面粉、全麦粉、非标准面包品、非标准整蛋、非标准蛋黄及转基因蛋黄素内的菌黑曲霉PLA-54[Aspergillus niger (PLA-54)]派生磷脂酶A2的临时营销售批准。 加拿大卫生署收到一份要求准用一种转基因菌黑曲霉杆菌派生的，携带该酶的猪胰基因编码的磷脂酶提案。磷脂酶属粗分类脂肪酶。现有数据评估支持由转基因菌黑曲霉派生的这种磷脂酶A2是安全有效的。因此，加拿大卫生署拟议修改食品药物法规，准许这种黑曲霉派生磷脂酶A2按药品生产质量管理规范(GMP)用于生产面包、面粉、全麦粉、非标准面包品、非标准整蛋、非标准蛋黄及转基因蛋黄素。作为改善协调机制应答能力的手段之一，在履行修改法规协调程序的同时，特发布临时营销许可，准许按GMP要求直接使用这种磷脂酶A2；且准许销售用上述物质制作的食品。 有关此项的最终规定将在12-18个月内批准并生效。通报评议截止日期为2009年12月24日。

卫生部在2011年第12号卫生部公告中发布了4项食品安全国家标准，其中之一即为《GB 2760-2011 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（以下简称新标准），该新标准将于2011年6月20日起正式实施，新标准的前言中明确指出对2007版的《GB 2760-2007 食品添加剂使用卫生标准》（以下简称旧标准）部分内容进行了调整，食品伙伴网已经对食品分类系统及食品工业用加工助剂的调整分别进行了详细的对比，详细内容见GB2760-2011与GB2760-2007标准对比分析之一——食品分类系统：GB2760-2011与GB2760-2007标准对比分析之二——食品工业用加工助剂，本次继续对食品用酶制剂进行详细的对比分析，希望通过这样的系列对比分析，食品行业人士能够对新标准的使用有更深入的了解。 本次对比分析的总体情况：旧标准中列举食品用酶制剂共45种，而新标准中列举食品用酶制剂是52种，经过对比发现旧标准中有两种酶制剂没有在新标准中收录。新标准中新增了9种食品用酶制剂。具体结果如下： 新标准中增加的食品用酶制剂名单，共9种，分别是：单宁酶、谷氨酰胺酶、核酸酶、环糊精葡萄糖苷转移酶、磷脂酶、磷脂酶A2、磷脂酶C、天门冬酰胺酶、脱氨酶。 新标准中删除的食品用酶制剂名单，共2种，分别是：磷酸酯酶、磷酸酯酶A2。 以上对比分析如有错误之处还望广大网友及时指正。

食品中磷脂的检测和分析马心茹一、磷脂的结构和功能磷脂（phospholipids）是一类含有磷酸基团的脂质，其广泛存在于植物油、大豆、蛋黄、乳制品、肉类和鱼类中。磷脂也是一类被熟知的极性脂类（polarlipids）,根据其主体碳链结构的不同，可主要分为甘油磷脂（glycerophospholipids）和鞘磷脂（sphingolipids）两大类。甘油磷脂主要包含了磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine,PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine,PE）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,PI）和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），鞘磷脂则主要为神经鞘磷脂（sphingomyelin，SM）。除了以上常见的五种磷脂外，学者们还发现了一些微量磷脂成分，如磷脂酸（phosphatidicacid，PA）、磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol，PG）、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine,LPE）、缩醛磷脂（plasmalogens）、葡糖神经酰胺（glucoceramide，GluCer）和乳糖神经酰胺（lactoseceramide，LacCer），其中GluCer和LacCer都属于鞘磷脂，LPC和LPE分别为PC和PE的代谢产物。磷脂在乳中的存在形式为乳脂肪球滴（milkfatglobule），是乳脂肪球膜（milkfatglobulemembrane，MFGM）的主要组成物质，由于其两亲性（amphiphilic）特征，磷脂在乳中起到了维持乳脂物理稳定性的作用，也通常被用作乳化剂添加到食品中。磷脂种类繁多，因拥有多种同分异构体和异形物，使得其检测方法异常复杂。磷脂是细胞和某些活性酶的重要组成成分,能调节机体膜功能,促进和改善胃肠功能,保护和增强肝脏功能,调整血脂、防止动脉粥样硬化,消除大脑疲劳、改善记忆力等。磷脂具有良好的乳化、润湿、分散等作用,在食品、医药、化妆品等行业具有广泛的应用,磷脂作为食品添加剂,能够提高加工过程中食品的稳定性 精制磷脂添加在化妆品中,可以改善皮肤状态、润滑受损毛发 牲畜或水产饲料中加入磷脂,可以改善它们的生长状况 磷脂也是注射液乳剂中常用的材料,可以制备药物复合物,提高药物的利用度。二、磷脂的提取磷脂的提取方法包括有机溶剂提取法、超临界CO2萃取法、柱层析法、酶解法、复合盐沉淀法等方法。（1）有机溶剂萃取法有机溶剂萃取法是根据各磷脂组分和杂质在有机溶剂中的溶解度不同,来实现磷脂与杂质的分离,常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇、氯仿等,提取时常常是几种溶剂联合使用以提高磷脂的提取率和纯度。有机溶剂提取法常与超声波萃取、超高压萃取、微波萃取等方法联用以提高萃取效率（2）超临界萃取法超临界萃取(supercriticalfluidextraction,SCF)技术是利用超临界状态下的CO2具有气体和液体的双重特性,通过改变温度和压力来调整流体的性质,从而对样品中的目标物质进行萃取的方法。为了获得更好的提取效果,使用超临界CO2提取磷脂时通常会加入夹带剂,最常用的夹带剂是乙醇,也有研究者使用丙烷等作为夹带剂。超临界CO2具有高扩散性、可重复利用、无污染以及选择性好等特点,但该方法所用设备价格昂贵,且样品处理量少,不适合商业化生产。（3）柱层析法柱层析法是根据样品混合物中各组分在吸附剂和洗脱剂中分配系数的不同,通过多次反复洗脱将磷脂与其它组分分离。柱层析法常用硅胶、氧化铝、硅藻土等作为吸附剂,氯仿、甲醇、乙醚、丙酮等作为洗脱剂。柱层析法分离效果好,操作简单,是目前高纯度磷脂制备的重要方法,但是处理量有限,而且要使用一些具有毒性的有机溶剂,从而限制了该方法在工业上的推广应用。（4）无机盐复合沉淀法无机盐复合沉淀法主要用来萃取卵磷脂,利用某些无机盐与卵磷脂结合可形成络合物沉淀,使卵磷脂与其他物质分离开,从而除去蛋白质和脂肪等杂质,再利用适当的溶剂把无机盐从磷脂复合物中萃取出来,从而获得较高纯度的磷脂。该方法提取率较高,但是最后需要将金属沉淀剂从磷脂中分离出来,操作较复杂。三、磷脂的定性和定量分析（1）钼蓝法钼蓝比色法分析原理是将植物油中的磷脂经灼烧成为五氧化二磷，被热盐酸变成磷酸，遇钼酸钠生成磷钼酸钠用硫酸联氨还原成钼蓝。然后按照国标方法绘制磷标准曲线用分光光度计在波长650nm对标准溶液进行吸光度的测定，并以此绘制标准曲线，计算样品中磷含量。具体操作：取六支比色管,编成0、1、2、4、6、8六个号码。按号码顺序分别注人标准溶液0mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL,再按顺序分别加水10mL、9mL、8mL、6mL、4mL、2mL。接着向六支比色管中分别加人硫酸联氨溶液(6.9)8mL,钼酸钠溶液2mL。加塞,振摇3次~4次,去塞,将比色管放人沸水浴中加热10min,取出,冷却至室温。用水稀释至刻度,充分摇匀,静置10min。移取该溶液至干燥、洁净的比色皿中,用分光光度计在650nm处,用试剂空白调整零点,分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标,含磷量(0.01mg、0.02mg、0。04mg、0.06mg、0.08mg)为横坐标绘制标准曲线。根据试样的磷脂含量,用坩埚称取制各好的试样,成品油试样称量10g,原油及脱胶油称量3.0g~3.2g(精确至0.001g)。加氧化锌0.5g,先在电炉上缓慢加热至样品变稠,逐渐加热至全部炭化,将坩埚送至550℃~600℃的马弗炉中灼烧至完全灰化(白色),时间约2h。取出坩埚冷却至室温,用10mL盐酸溶液溶解灰分并加热至微沸,5min后停止加热,待溶解液温度降至室温,将溶解液过滤注人100mL容量瓶中,每次用大约5mL热水冲洗坩埚和滤纸共3次~4次,待滤液冷却到室温后。用氢氧化钾溶液中和至出现混浊,缓慢滴加盐酸溶液使氧化锌沉淀全部溶解,再加2滴。最后用水稀释定容至刻度,摇匀。制备被测液时同时制备一份样品空白。用移液管吸取被测液10mL,注人50mL比色管中。加入硫酸联氨溶液8mL,钼酸钠溶液2mL。加塞,振摇3次~4次,去塞,将比色管放人沸水浴中加热10min,取出,冷却至室温。用水稀释至刻度,充分摇匀,静置10min。移取该溶液至干燥、洁净的比色皿中,用分光光度计在650nm下,用试样空白调整零点,测定其吸光度。（2）重量法植物油中的磷脂吸水膨胀,密度增大,使其由絮状悬浮物转变为沉淀物。将试样水化后,用丙酮反复洗涤过滤,由于磷脂不溶于丙酮,油溶于丙酮,从而可使得磷脂与油分离。称量磷脂的质量,计算其含量。该方法所得到的沉淀过滤物不完全是磷脂,还有其他不溶于丙酮的类脂物质。（3）薄层色谱法（thinlayerchromatography，TLC）TLC是根据展开剂中磷脂各组分与薄层板上吸附剂之间作用力不同、比移值（Rf）不同而达到分离磷脂组分目的的一种检测手段，TLC通常用于磷脂的定性和半定量测定，是最早应用于磷脂检测的方法之一。TLC的优点是操作简单、快速、直观、专业要求低、前期设备资金投入少，但其自动化程度低，多数情况下适用于实验室规模的检测，难以应用到工业界大规模样品的批检中。Morrison等、Christie等和Weihrauch等在上世纪60-80年 开始研究TLC及2D-TLC对乳及乳制品中磷脂含量的检测方法，检测基质包括母乳、牛乳、水牛乳、羊乳、山羊乳、骆驼乳、驴乳和奶酪等，报道列出了5大类磷脂分量（PE、PI、PS、PC、SM）在各动物基乳中的组分，其含量和其他检测手段得出的结果基本属于同一范围。Sanchez-Juanes等在2009年报道使用一种更先进的高效薄层色谱（high-performancethinlayerchromatography，HPTLC）技术对生牛乳进行磷脂组分分析。近年来，随着仪器的革新和技术的发展，TLC在国内外磷脂类化合物的检测中已较少使用，取而代之的是更少受人为因素影响的色谱、质谱和核磁共振等精密仪器（4）液相色谱-蒸发光散射法（high-performanceliquidchromatography-evaporativelightscatteringdetector，HPLC-ELSD）HPLC用于磷脂检测的技术在近些年得到飞速进步，并获得了广泛的认可和应用。HPLC法的突出优点在于其能使非挥发性的、热敏感的磷脂在常温得到分离，且其封闭系统能最大限度地减少磷脂在分析过程中被氧化的程度，确保实现磷脂快速、灵敏、准确、可重复的定量分析。HPLC可配置多种检测器，包括紫外检测器（ultraviolet，UV）、蒸发光散射器（ELSD）、电荷气溶胶探测器（chargedaerosoldetector，CAD）和质谱仪（massspectrometer，MS）等，其中，ELSD和MS应用最为广泛。ELSD的检测原理是把挥发性高的流动相喷入带热气流的检测器中，待其蒸发后，不挥发的磷脂形成微小液滴，这些液滴散射的光进入光电倍增器后产生电流，依据不同质量的磷脂引起电流大小的差异来达到检测的目的。ELSD是一种相对新型的检测器，它与UV、CAD和MS相比拥有诸多优点，如适用范围宽、检测时不存在基线漂移、对溶剂流速不敏感、能消除流动相梯度洗脱对结果带来的不良影响等，其在乳制品等复杂基质领域有很强的应用，正在逐渐成为磷脂分析检测的主流方法[5,34]。国际卵磷脂和磷脂协会（ILPS）于2003年推荐HPLC-ELSD法用于测量卵磷脂中的磷脂组分[51]，美国分析化学家学会（AOAC）也在2007年将HPLC-ELSD法收录为分析卵磷脂的标准检测方法。（5）核磁共振磷谱（31phosphorus-nuclearmagneticresonance，31P-NMR）31P-NMR用于磷脂检测是二十世纪七十至九十年代发展成熟的技术，其在分析生理组织（大脑、肝脏、细胞膜等）和食品（植物油、肉类等）中磷脂含量的领域展现出了很强的应用。31P-NMR拥有很高的灵敏度，能检出样品中低浓度含量的磷脂，近年来，该方法也被开发应用于乳制品等复杂基质。31P-NMR的优势在于不需要对样品进行大量的化学处理，且定量分析时不需要标准品，只需在总脂肪中加入内标。然而，31P-NMR仪器普及度不高，仪器运营费用昂贵，对实验员操作的熟练程度也要求较高，所以在资金、人员、设备上投入相对较大。31P-NMR的基本原理是检测磷脂分子中的每个磷原子，基于各组分在不同的化学环境中会呈现出不同的31P化学位移，利用其31P核磁共振效应来确定不同组分。Andreotti等使用31P-NMR对牛乳和水牛乳中的磷脂进行了定量分析，结论表示两种乳中磷脂种类的分布大体一致。Carcia等采集了不同种类哺乳动物（牛、骆驼、马）乳中磷脂的指纹图谱，并与人乳比对。结果显示，人乳和骆驼乳中富含对婴幼儿发育起到重要作用的神经鞘磷脂（分别为7.83mg/100mL和11.8mg/100mL）和缩醛磷脂（分别为2.7mg/100mL和2.4mg/100mL）；磷脂总量在四类乳中的排序为骆驼乳（0.503mmol/L）母乳（0.324mmol/L）牛乳（0.265mmol/L）马乳（0.101mmol/L）。Murgia等鉴别和定量分析了羊乳乳脂和牛乳乳脂中的磷脂组分，文中引进了单相二甲基甲酰胺/三乙基胺/盐酸胍作为溶剂体系，相比于传统的氯仿/甲醇/EDTA-水溶剂体系，新法能显著提高谱图峰的分辨率并降低化合物信号位移。MacKenzie等[51]对奶油和磷脂原料（PC700，BPC60）中的PC、PE、PS、PI、SM含量进行了检测，并与2D-TLC法做出对比，两种方法得出的磷脂组分基本属于同一范围。其中，奶油中磷脂总量分别为0.14%w/w（TLC法）和0.16%w/w（31P-NMR法）；PC700分别为53.2%w/w（TLC法）和60.6%w/w（31P-NMR法）；BPC60分别为72.9%w/w（2D-TLC法）和75.8%w/w（31P-NMR法）。MacKenzie的结果显示2D-TLC法灵敏性更高，能检出31P-NMR无法检出的低含量组分，但31P-NMR更适合高效率地规模化运作，因其自动化程度更高且耗时更短。（6）液相色谱-质谱检测器（high-performanceliquidchromatography-massspectrometer，HP[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]）MS最大的优势在于其拥有更好的精密度、灵敏性、特异性和更强的定性能力，它不仅可以检测磷脂总量和分量，更可以精确到各分子种类进行定性和结构分析。目前，MS被认为是测定磷脂分量及分子种类最精确的手段，其结合三重四极杆或飞行时间质谱仪将成为此领域新的发展方向。然而，MS的购买、运行和维修费用非常昂贵，且存在同位素峰间干扰和结果再现性不稳定等问题，故而其全面推广受到限制。即便如此，磷脂检测技术结合MS仍具有广阔的前景，近些年涌现出大量针对乳制品应用的报道。与液相、核磁共振方法不同的是，质谱仪通常串联离子源（ESI、EI、ICP等）、质量分析器（四极杆、四极杆离子阱、飞行时间等）和检测器（电子倍增器、感应电荷检测器等）共同使用，多种仪器组件的叠加增加了其检测方法的复杂性。通常，质谱类检测器使用的色谱柱多为反向柱（如C8、C18柱）或亲水作用色谱柱（hydrophilicinteractionliquidchromatography/HILIC柱），使用的流动相体系通常为氯仿：甲醇：缓冲液/水或乙腈：甲醇：缓冲液/水。此处值得一提的是HILIC柱的应用，HILIC柱是一类既非正向柱也非反向柱的特殊色谱柱，其采用了类似正向柱的固定相，但具备反向柱的部分特征。HILIC柱是一类高效的极性物质保留柱，通过亲水性作用力（hydrophilicinteraction）实现对极性物质的分离和洗脱，它能有效地改善反向色谱柱极性物质保留性差的缺点，并能有效提高电喷雾离子源的灵敏度，近些年受到了越来越广泛的关注。除此之外，质谱类检测器因能精确定量到磷脂分子种类，其在数据分析时结合主成分分析（PCA）能对磷脂进行指纹图谱的绘制，这一技术近年来发展快速。四、结语磷脂在食品、医药等行业中有广泛应用,优化和改进磷脂的提取和检测方法具有重要意义。目前在磷脂的提取和检测方面还存在许多挑战,在提取方面,多采用有机溶剂提取法,但存在溶剂残留等问题,超临界萃取法具有环保节能的优势,该方法主要用于实验室,在工业方面的应用有待增加 在检测方面,主要是HPLC-UV、HPLC-ELSD方法,由于磷脂的种类较多,脂肪酸组成差异较大,对于来源不同的磷脂,UV检测器不能准确定量,ELSD检测器是质量通用型检测器,可以比较准确地对磷脂进行定量分析,[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url]和NMR法对人员和设备要求比较高,目前还无法实现广泛应用。随着磷脂提取和检测技术的成熟,关于磷脂结构的分析会越来越多,可以更加全面的了解磷脂,使其更好地应用于生产和生活中。就磷脂提取而言，如何有效地去除杂质、提高萃取效率、确保检测结果的稳定性和重复性仍是目前存在的技术难点。SPE固相萃取小柱的应用，能有效且定向地对检测基质进行除杂，因其填料的多样性和创新性，SPE小柱在未来的应用或将逐步增加，但检测人员仍需考虑过柱带来的回收率上的损失。就定量方法而言，其未来发展趋势应根据需求进行划分：如针对企业进行相关产品检测，液相色谱-蒸发光散射器足以满足批检和抽检的需求；但从科研角度考虑，质谱类仪器无疑拥有更大的优势，这一点从近5年磷脂检测技术的发文趋势上可以看出。质谱类仪器因其精密性和高通量，现有技术已能对磷脂上百种分子种类进行定量分析，未来还能对更多未知的种类进行筛查及鉴别。除此之外，配合主成分分析手段，科研人员能对磷脂进行指纹图谱的绘制，这项技术在食品的真实性和溯源性鉴定上拥有巨大潜力。从表1汇总的数据来看，各文献报道的磷脂含量差异性较大，实验数据间难以互相做比，检测人员在参考数据时需对照所使用的检测方法和仪器条件。一点重要的启示是，新方法在开发时需经过缜密的方法学验证，需从精密度、检出限、定量限、回收率和线性关系等几个维度对方法进行综合评估，以得到最接近真值、有对比意义且重复性好的结果。参考文献[1]胡雪,段国霞,刘丽君,李翠枝,吕志勇,唐烁.乳及乳制品中磷脂的含量、功能、分离及检测技术研究进展[J/OL].食品科学:1-24[2021-07-06].[2]罗鑫,孙万成,罗毅皓.食品中鞘磷脂的检测及功能研究进展[J].食品研究与开发,2020,41(15):211-218.[3]刘黔霞,吴雪君,杨坤,张红,刘美霞,王凤霞.植物油中磷脂含量的测定[J].云南化工,2020,47(04):134-135.[4]文艺晓,彭吉星,郭莹莹,王婧媛,左红和,王联珠.HPLC-ELSD检测南极磷虾油中磷脂含量[J].南方农业学报,2019,50(10):2293-2299.[5]文艺晓,王联珠,彭吉星,郭莹莹,朱文嘉,王婧媛.食品中磷脂提取及分析方法的研究进展[J].食品安全质量检测学报,2019,10(07):1877-1883.[6]韩智,龚蕾,王会霞,江丰,朱晓玲,黄宗骞,曹琦.定量核磁共振磷谱在食品分析检测中的研究进展[J].食品与机械,2021,37(03):207-212.[7]工标网（www.csres.com）