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革兰氏染色法不仅用来观察细菌的形态,而且它还是细菌鉴定的重要方法,它可将全部细菌区分别革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。革兰氏染色法的步骤为:涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察。 涂片 与单染色法相同。 固定 与单染色法相同。 结晶紫染色 染色1分钟,然后水洗并用吸水纸吸干。 碘液媒染 染色1分钟,然后水洗并吸干。 酒精脱色 用95%酒精脱色,直到酒精不出现紫色时即停止(大约半分钟),然后立即水洗,并吸干。 番红复染 染色3分钟左右,然后水洗并吸干。 镜检 在显微镜油镜头下观察,菌体显蓝紫色的为革兰氏阳性菌;菌体显红色的为革兰氏阴性菌。
[size=18px][b][b]一、实验原理[/b][/b][/size] [b][size=17px]1.适用范围:[/size][/b][size=17px]芽孢染色法适用于能够形成芽孢的各类芽孢杆菌。[/size] [b][size=17px]2.原理:[/size][/b] [size=17px](1)芽孢染色法属于复[/size][size=17px]染色法,是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理,用不同染料进行着色,使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。[/size] [size=17px](2)芽孢壁厚、透性低,着色、脱色均较困难,因此,当先用一弱碱性染料,如孔雀绿或碱性品红在加热条件下进行染色时,此染料不仅可以进入菌体,而且也可以进入芽孢,进入菌体的染料可经水洗脱色,而进入芽孢的染料则难以透出,若再用复染液(如番红液)或衬托溶液(如黑色素溶液)处理,则菌体和芽孢易于区分。 [size=17px](3)芽胞具有高度的折光性,外膜致密,渗透性低,故普通染色法不易使其着色,芽胞染色法是根据芽胞既难以着色,而一旦着色又难以脱色的特点设计的。所有芽胞染色法都基于同一个原则:采用着色力强的染料,并加热以促进标本着色,然后使菌体脱色,而芽胞上的染料仍保留,经复染后,菌体和芽胞呈现不同的颜色。[/size] [size=17px][b][b][size=17px]二、染液的配制[/size][/b][/b][/size] [b][size=17px]1.5%孔雀绿水溶液:[/size][/b][size=17px]孔雀绿5.0g,蒸馏水100mL。[/size] [b][size=17px]2.0.5%番红溶液:[/size][/b][size=17px]番红O(safranine,又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL,溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中,用时取20mL与80mL蒸馏水混匀即可。[/size] [size=17px][b][b][size=17px]三、应用[/size][/b][/b][/size] [size=17px]芽孢染色法是生物学和医学领域中常用的实验技术,用于观察和研究细胞的结构和功能。芽孢的大小、形状及其在菌体内的位置是鉴别细菌的重要依据。[/size] [size=17px][b][b][size=17px]四、实验步骤 [/size][/b][/b][/size] [b][size=17px]1.[b]制[/b][/size][/b][size=17px][b]片[/b]:取洁净的载玻片,在载玻片上滴加一滴生理盐水,然后用接种环蘸取少量芽孢菌跟水混匀,晾干,用酒精灯固定。[/size] [b][size=17px]2.[/size][/b][size=17px][b]浸染[/b]:将固定好的涂片放入含5%孔雀绿水溶液的50[/size]℃水浴染色缸中,浸染15min。[size=17px]或者在涂片上滴加孔雀绿,用酒精灯加热,切勿干涸,要保持涂片湿润。 [/size] [b][size=17px]3.[/size][/b][size=17px][b]冲洗[/b]:取出载玻片,用水冲洗多余染液,直至出水无色为止。[/size] [b][size=17px]4.[/size][/b][size=17px][b]复染[/b]:0.5%碱性番红复染1min。[/size] [b][size=17px]5.[/size][/b][size=17px][b]冲洗[/b]:用水冲洗多余染液,直至出水无色为止,晾干。[/size] [b][size=17px]6.[/size]镜检:[/b]先低倍镜找到区域后,换油镜观察芽孢和菌体。[size=17px]菌体呈红色或粉色,而芽孢呈绿色。[/size] [size=18px][font=system-ui, -apple-system, BlinkMacSystemFont, &][b]五、[/b][/font][font=system-ui, -apple-system, BlinkMacSystemFont, &][b]注意事项和操作技巧[/b][/font][/size] [size=17px]1.选用适当菌龄的菌种,幼龄菌尚未形成芽孢,而老龄菌芽孢囊已经破裂。 [/size] [size=17px]2.加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状态,加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂,加热不够则芽孢难以着色。[/size]加热过程中要及时添加染色液,切勿让标本干涸。 3.芽孢观察也可以直接使用简单染色法。比如用番红或结晶紫染色后,芽孢不着色,菌体染色。[/size]
[b] 瑞氏染色法:染色方法和注意事项 (1)血涂片干透后固定,否则细胞在染色过程中容易脱落。 (2)冲洗时应以流水冲洗,不能先倒掉染液,以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久,以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积,可滴加甲醇,然后立即用流水冲洗。 (3)染色过淡可以复染,复染时应先加缓冲液,然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡,也可用甲醇脱色。 (4)瑞氏染色Ⅰ液由瑞氏染料、甲醇(AR级以上)和甘油组成,Ⅱ液为磷酸盐缓冲液(pH6.4~pH6.8)。 瑞氏(Wright)染色液的配制方法 瑞氏(Wright)染色液 瑞氏染料粉末0.3g 甘油3ml 甲醇97ml 将染料粉末置于干燥的乳缽内研磨,先加甘油,后加甲醇,放玻璃瓶中过夜,过滤即可。 [/b]