苦玄参

玄参，别名：元参、乌元参、黑参、重台、鬼藏、正马、鹿肠、玄台、逐马、馥草、野脂麻、山当归、水萝卜多年生草本。根长圆柱形或纺锤形。茎具四棱，有沟纹。下部叶对生，上部叶有的互生，卵形至披针形，长10～15cm，边缘具细锯齿，齿缘反卷，骨质，并有突尖。聚伞圆锥花序大而疏散，轴上有腺毛；花萼5裂，裂片边缘膜片；花冠褐紫色，上唇长于下唇；退化雄蕊近圆形。蒴果卵形。花期7～8月，果期8～9月。根类圆柱形，中间略粗或上粗下细，有的微弯曲，长6～20cm，直径1～3cm。表面灰黄色或灰褐色，有不规则的纵沟、横向皮孔及稀疏的横裂纹和须根痕。质坚实，不易折断，断面黑色，微有光泽。气特异似焦糖，味甘、微苦、咸。

[size=20px][color=#93c6bc][b]鉴别[/b][/color][/size][size=16px][color=#e2a4a4]｜[/color][/size] [b][font=宋体][/font][/b] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [font=宋体] （1）本品茎横切面：表皮细胞1列，嫩茎外被非腺毛。表皮下方有[color=var(--weui-LINK)]厚角组织[i][/i][/color]1～3列。皮层为4～6列薄壁细胞，在棱突处有类圆形韧皮纤维束。韧皮部细胞3～8层，老茎韧皮部细胞含黄棕色至红棕色物，呈一明显环带。形成层不明显。木质部导管较大连续成环，木射线细胞1～3列径向排列。髓部薄壁细胞较大，含草酸钙针晶或短柱晶。[/font] [font=宋体]（2）取本品粉末0.5g，加乙酸乙酯-甲醇（5：1）[color=var(--weui-LINK)]混合溶液[i][/i][/color]25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取苦玄参对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液，再取苦玄参苷I[sub]A[/sub]对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则 0502）试验，吸取上述三种溶液各3[/font][font=宋体]μ[/font][font=宋体]l[/font][font=宋体]，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（4：1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。[/font] [font=宋体]供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。[/font] [font=宋体][color=blue][/color][/font][font=宋体][/font] [size=20px][color=#93c6bc][b]检查[/b][/color][/size][size=16px][color=#e2a4a4]｜[/color][/size][b][font=宋体] [/font][/b] [font=宋体][/font] [font=宋体][/font] [b][font=宋体] 水分[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]不得过13.0%（通则0832第二法）。[/font] [b][font=宋体]总灰分[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]不得过13.0%（通则2302）。[/font] [b][font=宋体]酸不溶性灰分[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]不得过5.0%（通则2302）。[/font] [b][font=宋体]【[color=var(--weui-LINK)]浸出物[i][/i][/color]】[/font][/b][font=宋体] 照醇溶性浸出物测定法（通则2201）项下的热浸法测定，用70%乙醇作溶剂，不得少于13.0%。[/font] [b][font=宋体]【含量测定】[/font][/b][font=宋体] 照高效液相色谱法（通则0512）测定。[/font] [b][font=宋体]色谱条件与系统适用性试验[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]以[color=var(--weui-LINK)]十八烷基硅烷键合硅胶[i][/i][/color]为填充剂；以乙腈-水（35：65）为流动相；检测波长为264nm；柱温35℃。理论板数按苦玄参苷I[sub]A[/sub]峰计算应不低于4000。[/font] [b][font=宋体]对照品溶液的制备[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]取苦玄参苷I[sub]A[/sub]对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。[/font] [b][font=宋体]供试品溶液的制备[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]取本品粉末（过三号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇25ml，密塞，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用60%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。[/font] [b][font=宋体]测定法[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体]分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10[/font][font=宋体]μ[/font][font=宋体]l[/font][font=宋体]，注入液相色谱仪，测定，即得。[/font] [font=宋体]本品按干燥品计算，含苦玄参苷I[sub]A[/sub]（C[sub]41[/sub]H[sub]62[/sub]O[sub]13[/sub]）不得少于0.25%。[/font]

[font=宋体]内生真菌几乎无处不在地存在于植物体内的各种组织中，是多种生物活性化合物的重要储存宝库[/font][sup][1][/sup][font=宋体]。[/font][font=宋体]植物内生真菌作为一个巨大的资源库，与宿主共同进化，不仅能产生与宿主植物相似或相同的活性物质，还可以从中发现大量骨架新颖具有药用价值的次生代谢产物，是天然活性先导化合物的重要源泉之一[/font][sup][2-5][/sup][font=宋体]。[/font] [font=宋体]黑孢属[/font][i]Nigrospora[/i][font=宋体]菌株[/font][font=宋体]广泛分布于自然界，虽然是常见的植物病原菌[/font][sup][6][/sup][font=宋体]，但也是重要的药用动植物内生菌，能够产生多种次级代谢产物，主要有聚酮、蒽醌、萜、甾体和生物碱等，而且大部分化合物具有明显的抗菌、抗氧化、细胞毒、抗病毒和抗肿瘤等药理作用[/font][sup][7-8][/sup][font=宋体]。有作为先导药物和环保的农用化学品的潜力，在农业植物保护和人类疾病治疗领域均显示出较大的应用前景。[/font] [font=宋体]内生真菌[/font][i]Nigrospora oryzae [/i]D7[font=宋体]为首次从玄参[/font][i]Scrophularia ningpoensis[/i] Hemsl.[font=宋体]根中分离得到。本实验将对玄参内生真菌[/font][i]N. oryzae[/i][font=宋体]进行次生代谢产物的研究，期望发掘结构新颖的活性先导化合物。最终分离得到[/font]11[font=宋体]个化合物，分别鉴定[/font]4,5,8-[font=宋体]三羟基[/font]-6-[font=宋体]甲氧基[/font]-2-[font=宋体]甲基[/font]-3-2-[font=宋体]丙酰[/font]-3,4-[font=宋体]二氢萘[/font]-1(2[i]H[/i])-[font=宋体]酮[/font] [4,5, 8-trihydroxy-6-methoxy-2-methyl-3-(2-oxopropyl)-3,4-dihydronaphthalen-1(2[i]H[/i])-one[font=宋体]，[/font][b]1[/b]][font=宋体]、[/font]([i]S[/i])-2-[font=宋体]甲基[/font]-2,3-[font=宋体]二氢苯并呋喃[/font]-4-[font=宋体]羧酸[/font][([i]S[/i])-2-methyl-2,3-dihydro- benzofuran-4-carboxylic acid[font=宋体]，[/font][b]2[/b]][font=宋体]、[/font]3-[font=宋体]羟基[/font]-2-[font=宋体]甲氧基[/font]- 5,6-[font=宋体]二甲基苯甲酸（[/font]3-hydroxy-2-methoxy-5,6- dimethylbenzoic acid[font=宋体]，[/font][b]3[/b][font=宋体]）、[/font]2-[font=宋体]乙氧基[/font]-3-[font=宋体]羟基[/font]-5,6-[font=宋体]二甲基苯甲酸（[/font]2-ethoxy-3-hydroxy-5,6-dimethylbenzoic acid[font=宋体]，[/font][b]4[/b][font=宋体]）、[/font]2,4-[font=宋体]二羟基[/font]-3,6-[font=宋体]二甲基苯甲醛（[/font]2,4- dihydroxy-3,6-dimethyl benzaldehyde[font=宋体]，[/font][b]5[/b][font=宋体]）、[/font]2,5-[font=宋体]二甲基间苯二酚（[/font]2,5-dimethyl resorcinol[font=宋体]，[/font][b]6[/b][font=宋体]）、[/font]2-(4-[font=宋体]羟苯基[/font])[font=宋体]乙酸乙酯[/font] [2-(4-hydroxyphenyl) ethyl acetate[font=宋体]，[/font][b]7[/b]][font=宋体]、酪醇（[/font]tyrosol[font=宋体]，[/font][b]8[/b][font=宋体]）、[/font]α-acetylorcinol[font=宋体]（[/font][b]9[/b][font=宋体]）、[/font](20[i]S[/i],22[i]E[/i],24[i]R[/i])-5α,8α-[font=宋体]桥二氧[/font]-[font=宋体]麦角甾烷[/font]-6,22-[font=宋体]二烯[/font]- 3β-[font=宋体]醇[/font][5α,8α-epidioxy-(20[i]S[/i],22[i]E[/i],24[i]R[/i])-ergosta-6,22- dien-3β-ol[font=宋体]，[/font][b]10[/b]][font=宋体]、[/font](3β,5α,6β,22[i]E[/i])-[font=宋体]麦角甾[/font]-7,22-[font=宋体]二烯[/font]- 3,5,6-[font=宋体]三醇[/font][(3β,5α,6β,22[i]E[/i])-ergosta-7,22-diene-3,5,6- triol[font=宋体]，[/font][b]11[/b]][font=宋体]、其中化合物[/font][b]1[/b][font=宋体]为新的萘醌类化合物，命名为稻黑孢醌[/font]A[font=宋体]；活性测试结果表明化合物[/font][b]1[/b][font=宋体]对人肺癌细胞[/font]A549[i][/i][font=宋体]和人乳腺癌细胞[/font]MDA-MB-435[font=宋体]细胞株具有较强的生长抑制活性，半数抑制浓度（[/font]median inhibition concentration[font=宋体]，[/font]IC[sub]50[/sub][font=宋体]）分别为（[/font]9.25[font=宋体]±[/font]1.60[font=宋体]）、（[/font]11.37[font=宋体]±[/font]2.10[font=宋体]）[/font]μmol/L[font=宋体]；化合物[/font][b]10[/b][font=宋体]和[/font][b]11[/b][font=宋体]对[/font]A549[font=宋体]细胞的增殖有一定的抑制活性，[/font]IC[sub]50[/sub][font=宋体]分别为（[/font]25.23[font=宋体]±[/font]2.50[font=宋体]）、（[/font]27.48[font=宋体]±[/font]1.90[font=宋体]）[/font]μmol/L[font=宋体]。[/font] [b][back=#ffacd5]1 [font=黑体]仪器与材料[/font][/back][/b]1.1 [font=黑体]仪器与试剂[/font]Agilent 1260[font=宋体]型高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱仪[/color][/url]（美国[/font]Agilent[font=宋体]公司）；[/font]Bruker Avance III 500 MHz[font=宋体]型核磁共振波谱仪（德国布鲁克公司）；[/font]MJ-150-I[font=宋体]型霉菌培养箱（上海精密仪器仪表有限公司）；[/font]BSD-YX[font=宋体]（[/font]F[font=宋体]）[/font]3400[font=宋体]立式摇床（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；[/font]RE-52C[font=宋体]旋转蒸发仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；[/font]YXQ-LS-75SⅡ[font=宋体]立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯）；[/font]Nicolet IS50[font=宋体]型光谱仪（美国赛默飞世尔科技有限公司）；[/font]JASCO J-810[font=宋体]型圆二色光谱仪（日本分光株式会社）；岛津[/font] [url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp][color=#3333ff]LC-MS[/color][/url] 8050[font=宋体]型质谱仪（日本岛津株式会社）；[/font]CYTATION[font=宋体]型多功能酶标仪（美国[/font]BioTek[font=宋体]公司）。[/font][font=宋体]柱色谱硅胶（[/font]200[font=宋体]～[/font]300[font=宋体]、[/font]400[font=宋体]～[/font]500[font=宋体]目）；反相柱（[/font]YMC Pack ODS-A[font=宋体]（[/font]250 mm[font=宋体]×[/font]10 mm[font=宋体]，[/font]5 μm[font=宋体]），日本[/font]YMC[font=宋体]公司）；[/font]TLC[font=宋体]（[/font]HSGF[sub]254[/sub][font=宋体]硅胶预制板，烟台黄务硅胶开发实验厂）。二氯甲烷、石油醚、乙醇、甲醇、醋酸乙酯等（分析纯，中国医药集团上海化学试剂公司），甲醇（高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]级，中国医药集团上海化学试剂公司）；阿霉素（批号[/font]S17092[font=宋体]，上海源叶生物科技有限公司）。[/font]PDA[font=宋体]培养基（马铃薯[/font]200 g[font=宋体]、葡萄糖[/font]20 g[font=宋体]、琼脂[/font]20 g[font=宋体]、水[/font]1 000 mL[font=宋体]）。[/font]PDB[font=宋体]培养液（马铃薯[/font]200 g[font=宋体]、葡萄糖[/font]20 g[font=宋体]、水[/font]1 000 mL[font=宋体]）；二甲基亚砜（[/font]DMSO[font=宋体]，上海生工生物工程有限公司）；[/font]CCK-8[font=宋体]试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；[/font]DMEM[font=宋体][color=var(--weui-LINK)]培养基[i][/i][/color]和特级胎牛血清（[/font]FBS[font=宋体]，美国[/font]Gibco[font=宋体]公司）。[/font]1.2 [font=黑体]菌株来源[/font][font=宋体]本研究所用菌株分离自新鲜玄参根（[/font]2017[font=宋体]年[/font]11[font=宋体]月采自浙江磐安大盘镇），植物经浙江中医药大学秦路平教授鉴定为玄参[/font][i]S. ningpoensis [/i]Hemsl.[font=宋体]，菌株经上海生工生物工程有限公司鉴定为[/font][i]Nigrospora oryzae[/i][font=宋体]（[/font]Genbank[font=宋体]序列号[/font]MH782625[font=宋体]）。样本储存于浙江中医药大学药学院。[/font]1.3 [font=黑体]细胞株[/font]A549[font=宋体]细胞和[/font]MDA-MB-435[font=宋体]细胞购自中国科学院上海细胞库。 [/font][b][back=#ffacd5]2 [font=黑体]方法[/font][/back][/b]2.1 [font=黑体]菌株发酵[/font][font=宋体]将内生真菌[/font]D7[font=宋体]接入[/font]250 mL[font=宋体]锥形瓶中（含[/font]100 mL PDB[font=宋体]培养基），[/font]26 [font=宋体]℃[/font][font=宋体]，[/font]180 r/min[font=宋体]旋转摇床培养[/font]7 d[font=宋体]后，转接入[/font]5 L[font=宋体]锥形瓶（含[/font]3 L[font=宋体]的[/font]PDB[font=宋体]培养基），培养[/font]10[font=宋体]瓶，静置于恒温培养箱中，于[/font]28 [font=宋体]℃[/font][font=宋体]，培养[/font]10 d[font=宋体]，得到[/font]30 L[font=宋体]左右的发酵液。[/font]2.2 [font=黑体]次生代谢产物的提取与分离[/font][font=宋体]将内生真菌[/font][i]N. oryzae[/i] D7[font=宋体]的发酵物用甲醇浸提[/font]3[font=宋体]次，粗提液用醋酸乙酯萃取后得到醋酸乙酯部位浸膏约[/font]14.5 g[font=宋体]，将该浸膏经硅胶柱色谱，石油醚[/font]-[font=宋体]醋酸乙酯系统（[/font]40[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]、[/font]30[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]、[/font]20[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]、[/font]10[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]、[/font]8[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]、[/font]5[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]、[/font]3[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]、[/font]1[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]、[/font]1[font=宋体]∶[/font]2[font=宋体]）梯度洗脱，经[/font]TLC[font=宋体]检测合并分成[/font]10[font=宋体]个组分（[/font]Fr. A1[font=宋体]～[/font]A10[font=宋体]）。对[/font]A1-1[font=宋体]组分进行硅胶柱色谱、[/font]HPLC[i][/i][font=宋体]纯化（甲醇[/font]-[font=宋体]水[/font]62[font=宋体]∶[/font]38[font=宋体]，[/font]1 mL/min[font=宋体]），得到化合物[/font][b]1[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]35.1 min[font=宋体]，[/font]2.4 mg[font=宋体]）；对[/font]A2-1[font=宋体]组分进行硅胶柱色谱、[/font]HPLC[font=宋体]纯化（甲醇[/font]-[font=宋体]水[/font]58[font=宋体]∶[/font]42[font=宋体]，[/font]1 mL/min[font=宋体]），得到化合物[/font][b]9[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]19.0 min[font=宋体]，[/font]2.2 mg[font=宋体]）、[/font][b]10[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]24.1 min[font=宋体]，[/font]2.9 mg[font=宋体]）、[/font][b]11[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]32.4 min[font=宋体]，[/font]2.4 mg[font=宋体]）、[/font][b]12[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]45.3 min[font=宋体]，[/font]2.7 mg[font=宋体]）；对[/font]A2-3[font=宋体]组分进行硅胶柱色谱、[/font]HPLC[font=宋体]纯化（甲醇[/font]-[font=宋体]水[/font]70[font=宋体]∶[/font]30[font=宋体]，[/font]1 mL/min[font=宋体]），得到化合物[/font][b]2[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]40.0 min[font=宋体]，[/font]3.1 mg[font=宋体]）、[/font][b]3[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]34.3 min[font=宋体]，[/font]2.1 mg[font=宋体]）、[/font][b]4[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]38.3 min[font=宋体]，[/font]2.3 mg[font=宋体]）、[/font][b]5[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]45.3 min[font=宋体]，[/font]2.6 mg[font=宋体]）。[/font][font=宋体]将[/font]A4-3-1[font=宋体]组分进行[color=var(--weui-LINK)]凝胶柱[i][/i][/color]色谱、反相硅胶柱色谱、[/font]HPLC[font=宋体]纯化（甲醇[/font]-[font=宋体]水[/font]52[font=宋体]∶[/font]48[font=宋体]，[/font]1 mL/min[font=宋体]），得到化合物[/font][b]6[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]32.5 min[font=宋体]，[/font]2.7 mg[font=宋体]）、[/font][b]7[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]22.5 min[font=宋体]，[/font]2.4 mg[font=宋体]）、[/font][b]8[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]46.2 min[font=宋体]，[/font]2.4 mg[font=宋体]）；对[/font]A7-1[font=宋体]组分进行硅胶柱色谱、[/font]HPLC[font=宋体]纯化（甲醇[/font]-[font=宋体]水[/font]56[font=宋体]∶[/font]44[font=宋体]，[/font]1 mL/min[font=宋体]），得到[/font][font=宋体]化合物[/font][b]13[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]21.0 min[font=宋体]，[/font]3.2 mg[font=宋体]）、[/font][b]14[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]25.1 min[font=宋体]，[/font]3.4 mg[font=宋体]）、[/font][b]15[/b][font=宋体]（[/font][i]t[/i][sub]R[/sub][font=宋体]＝[/font]32.6 min[font=宋体]，[/font]3.4 mg[font=宋体]）。 [/font][b][back=#ffacd5]3 [font=黑体]结果[/font][/back][/b]3.1 [font=黑体]结构鉴定[/font][font=宋体]化合物[/font][b]1[/b][font=宋体]：黄色粉末，溶于甲醇，丙酮。[/font]10%[font=宋体]硫酸乙醇显色剂显棕色。[/font]HR-ESI-MS[font=宋体]给出准分子离子峰[/font][i]m[/i]/[i]z[/i]293.102 5 [M[font=宋体]－[/font]H][sup]?[/sup][font=宋体]，结合[/font][sup]1[/sup]H-NMR[font=宋体]、[/font][sup]13[/sup]C-NMR[font=宋体]，知其分子式为[/font]C[sub]15[/sub]H[sub]18[/sub]O[sub]6[/sub][font=宋体]；[/font][sup]1[/sup]H-NMR[font=宋体]谱中可观察到[/font]1[font=宋体]个双峰甲基[/font]1.16 (3H, d, [i]J[/i]= 7.0 Hz)[font=宋体]、[/font]1[font=宋体]个单峰甲基[/font]2.08 (3H, s) [font=宋体]以及[/font]1[font=宋体]个甲氧基[/font]3.92 (3H, s)[font=宋体]，在低场有[/font]1[font=宋体]个单峰苯环质子信号[/font]6.47 (1H, s)[font=宋体]。在碳谱中显示共有[/font]15[font=宋体]个碳信号，其中[/font]1[font=宋体]个为连氧碳信号[/font]55.3[font=宋体]（[/font]CH[sub]3[/sub][font=宋体]）、[/font]1[font=宋体]个甲氧基碳、[/font]2[font=宋体]个羰基碳信号[/font]208.3[font=宋体]（[/font]C[font=宋体]），[/font]204.5[font=宋体]（[/font]C[font=宋体]），[/font]1[font=宋体]个甲基碳信号[/font]10.7[font=宋体]（[/font]CH[sub]3[/sub][font=宋体]）。在高场有[/font]5[font=宋体]个碳，低场有[/font]6[font=宋体]个双键或苯环碳，结合以上信号可以推测化合物[/font][b]1[/b][font=宋体]为[/font]1[font=宋体]个萘醌类化合物，且结构与已知化合物[/font]fusarnaphthoquinone A[sup][9][/sup][font=宋体]极为相似，但该结构有[/font]1[font=宋体]个明显的甲基质子信号[/font]1.16 (3H, d)[font=宋体]。[/font][font=宋体]在二维谱[/font][sup]1[/sup]H-[sup]1[/sup]H COSY [font=宋体]中观察到[/font]H-7[font=宋体]和[/font]H-12[