巨噬细胞

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的生物质谱和毛细管电泳法

[size=14px] [/size] [size=14px]含笑内酯（Micheliolide，MCL）是小白菊内酯衍生物，具有抗氧化和抗炎作用，在肿瘤和炎症疾病中发挥多种功能。先前的文献还表明MCL可作为NF-κB的特异性抑制剂，抑制炎症因子的表达。此外，还有研究发现MCL通过调节NF-κB通路来防止阿霉素诱导的心脏毒性。然而，MCL对动脉粥样硬化（AS）进展和巨噬细胞铁死亡的影响仍不清楚。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2023年12月7日，哈尔滨医科大学第二附属医院贾海波团队在Redox Biol（IF=11.4）发表题为“MCL attenuates atherosclerosis by suppressing macrophage ferroptosis via targeting KEAP1/NRF2 interaction”的研究文章，发现MCL对AS具有保护作用。机制上，MCL 通过与 NRF2 竞争结合KEAP1的Arg483位点来促进KEAP1/NRF2解离，激活NRF2通路增加 GPX4和xCT来抑制巨噬细胞铁死亡和线粒体功能，减少炎症反应并改善了氧化应激，从而减缓AS的进展。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]Highlights[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]1）MCL减弱AS的发展，减少了炎症反应并改善了氧化应激；[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2）MCL抑制巨噬细胞铁死亡和线粒体功能，从而减缓AS的进展；[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]3）MCL通过激活NRF2通路增加GPX4和xCT来抑制铁死亡；[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]4）MCL通过与NRF2竞争结合KEAP1的Arg483位点来促进KEAP1/NRF2解离。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]研究结果[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]1、MCL给药减缓ApoE ?/?小鼠的AS进展[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]作者首先研究了MCL是否对AS有保护作用，ApoE?/?小鼠被喂养补充有MCL的西式饮食16周，发现MCL不仅减轻AS的发展，而且还改善了ApoE?/?小鼠脂质水平和炎症反应[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]2、MCL 抑制巨噬细胞铁死亡并改善动脉粥样硬化斑块中的氧化应激[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]鉴于巨噬细胞铁死亡在AS发展中的重要作用，作者推测MCL是否可能通过抑制巨噬细胞铁死亡来改善AS，通过检测GPX4和xCT mRNA和蛋白水平，检测血清铁含量、MDA和4-HNE水平，结果均表明MCL可能通过抑制巨噬细胞铁死亡来延缓AS的发展[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]3、MCL体外抑制巨噬细胞铁死亡及改善ox-LDL诱导的氧化应激[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]已有研究报道ox-LDL可引起巨噬细胞铁死亡，作者发现MCL可增加ox-LDL处理的巨噬细胞的细胞活力并降低上清液中的LDH水平，且MCL预处理可显著防止巨噬细胞线粒体的超微结构变化，改善巨噬细胞中的脂质ROS水平，逆转巨噬细胞中降低的GPX4和xCT水平。此外，MCL降低ox-LDL处理的巨噬细胞中的MDA水平，升高SOD活性和GSH水平，降低ox-LDL 诱导的巨噬细胞中铁离子浓度的升高[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]此外，作者还检测了线粒体功能，发现MCL显著改善ox-LDL引起的膜电位损失，改善线粒体功能。与仅用ox-LDL处理的细胞相比，用MCL孵育的ox-LDL处理的细胞的基础、最大和ATP偶联的线粒体耗氧率显著增加。这些数据表明MCL显著抑制巨噬细胞铁死亡，改善线粒体功能[/size] [size=14px] [/size][size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]4、MCL增强ox-LDL培养的巨噬细胞中NRF2核转位[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]先前研究报道NRF2调节GPX4和xCT的转录，作者推测MCL是否可能激活NRF2通路从而增加巨噬细胞中的GPX4和xCT表达。结果发现MCL降低了细胞质裂解物中NRF2蛋白的表达，但显著增加细胞核裂解物中NRF2蛋白水平。此外，ChIP-q[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url]实验发现MCL处理后NRF2对GPX4和xCT启动子序列的富集显著增加，这些数据表明MCL增强了NRF2核转位并增加了GPX4和xCT转录[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]5、MCL通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞铁死亡减轻AS[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为进一步证实MCL通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞铁死亡，作者采用NRF2特异性抑制剂M385预处理巨噬细胞，发现MCL治疗后升高的GPX4和xCT蛋白表达被ML385显著消除，且ML385抑制NRF2可消除MCL对脂质ROS和线粒体损伤的保护作用，此外，ML385可消除MCL诱导的GSH水平和SOD活性。用Si-NRF2降低巨噬细胞中NRF2水平，结果与ML385一致。这些数据表明MCL通过激活NRF2通路抑制巨噬细胞铁死亡[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]此外，为了证明MCL通过激活体内NRF2通路保护AS ，作者通过尾静脉给ApoE ?/?小鼠注射了AAV-sh-NRF2和AAV-sh-NC，同样发现MCL通过激活NRF2通路来保护动脉粥样硬化并改善炎症反应[/size] [size=14px]6、MCL抑制NFR2与KEAP1结合促进NRF2核转位[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]NRF2活性主要受其与KEAP1相互作用的调节。在生理条件下，KEAP1可以与NRF2相互作用形成复合物，抑制NRF2的核易位，进而导致其通过泛素化降解。作者发现ox-LDL促进NRF2和KEAP1复合物的形成，而MCL抑制了这种作用。作者接着通过分子对接来预测MCL是否可以直接与KEAP1结合，发现MCL分别与KEAP1的Gly364、Asn414、Arg483 和Ala556结合。进一步免疫沉淀和免疫荧光实验表明KEAP1-R483S突变体消除了MCL促进NRF2核转位的作用，表明MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点促进 KEAP1/NRF2 解离和NRF2核转位（图8）。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]7、MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点抑制巨噬细胞铁死亡并改善线粒体功能[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]作者进一步研究了MCL是否抑制KEAP1-R483S突变巨噬细胞中的铁死亡，发现在KEAP1-R483S突变的巨噬细胞中，MCL不能改善ox-LDL诱导的细胞活力下降和LDH水平升高。此外，MCL对降低 KEAP1-R483S 突变巨噬细胞中总ROS和线粒体ROS的作用也消失，在巨噬细胞中转染 KEAP1-R483S减弱MCL对GPX4和xCT上调的影响。此外，MCL降低KEAP1-WT巨噬细胞中的铁含量和脂质ROS水平，但这种作用在KEAP1-R483S突变巨噬细胞中被消除，在 KEAP1-R483S 突变的巨噬细胞中，MCL对线粒体损伤的保护作用被抑制（图9）。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]此外，MCL不能改善ox-LDL 诱导的KEAP1-R483S突变巨噬细胞中细胞膜电位的丧失。KEAP1-R483S质粒转染减轻了MCL对线粒体功能的保护作用，氧消耗分析也显示MCL不能增加被KEAP1-R483S质粒感染的巨噬细胞的OCR。这些结果表明MCL通过竞争性地与KEAP1的Arg483位点结合来抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞铁死亡（图10）。[/size] [size=14px] [/size] [size=14px] [/size] [size=14px]8、携带 AAV-KEAP1-R483S 的ApoE ?/?小鼠中MCL的 AS保护作用减弱[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]为了进一步证实MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483对AS的保护作用，将含有 KEAP1-WT和KEAP1-R483S的AAV通过尾静脉注射到8周龄ApoE ?/?小鼠体内，发现在 KEAP1-R483S突变小鼠中，MCL的抗炎作用、改善脂质沉积作用、提升GPX4，xCT和NRF2表达的作用均受到抑制。这些结果表明MCL通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点来抑制巨噬细胞铁死亡和AS进展[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]总结[/size] [size=14px] [/size] [size=14px]研究首次报道了MCL对AS的保护作用，阐明了MCL抑制AS的具体机制。MCL通过改善氧化应激抑制巨噬细胞铁死亡来抑制动脉粥样硬化，机制上通过竞争性结合KEAP1的Arg483位点促进NRF2活化，研究结果为MCL在AS治疗中的机制提供了新的见解，并提供了一种通过与NRF2竞争性结合KEAP1的Arg483位点来抑制巨噬细胞铁死亡，从而限制斑块进展的治疗方法。[/size]

[size=15px][font=宋体]结直肠癌（[/font][font=&]Colorectal Cancer[/font][font=宋体]，[/font][font=&]CRC[/font][font=宋体]）是全球常见的恶性肿瘤，术后复发转移已成为结直肠癌患者死亡的主要原因，特别是结直肠癌肝转移（[/font][font=Georgia, &][color=#333333]CRLM[/color][/font][font=宋体]）。因此，迫切需要深入研究[/font][font=Georgia, &][color=#333333]CRLM[/color][/font][font=宋体]的病理和分子机制。原发性肿瘤细胞与远端器官中的免疫细胞或基质细胞之间的信息传递是转移前微环境（[/font][font=&]PMN[/font][font=宋体]）形成的关键因素，了解这一机制对于制定有效的肿瘤转移治疗策略至关重要。[/font][font=&][/font][/size][size=15px][font=宋体]细胞外囊泡（[/font][font=&]EV[/font][font=宋体]）作为各种细胞分泌的功能实体，富含蛋白质、核酸、脂质和其他分子，促进肿瘤细胞和基质细胞之间的重要通讯。越来越多的报道表明，肿瘤衍生的[/font][font=&]EV[/font][font=宋体]（[/font][font=&]TEV[/font][font=宋体]）有助于[/font][font=&]PMN[/font][color=#333333]和[/color][font=Georgia, &][color=#333333]CRLM[/color][/font][font=宋体]的形成，为转移器官中循环肿瘤细胞的增殖提供必需肿瘤微环境（[/font][font=&]TME[/font][font=宋体]）。作者推测[/font][font=&]circRNA[/font][font=宋体]富集的[/font][font=&]TEVs[/font][font=宋体]介导[/font][font=&]PMN[/font][font=宋体]的形成，并且靶向[/font][font=&]circRNA[/font][font=宋体]富集的[/font][font=&]TEVs[/font][font=宋体]可能是针对[/font][font=&]PMN[/font][font=宋体]形成和[/font][font=&]CRLM [/font][font=宋体]的有效治疗策略。[/font][/size][size=15px][font=宋体]肿瘤细胞分泌的富含[/font][font=&]circ-0034880[/font][font=宋体]的细胞外囊泡通过增强[/font][font=&] SPP1[sup]high[/sup]CD206[sup] +[/sup][/font][font=宋体]促肿瘤巨噬细胞的活化来促进结直肠癌肝转移。重要的是，研究确定人参皂苷[/font][font=&]Rb1[/font][font=宋体]是一种潜在的治疗剂，通过直接靶向[/font][font=&]QKI [/font][font=宋体]蛋白，从而减少[/font][font=&]circ-0034880[/font][font=宋体]的生物合成并抑制[/font][font=&]SPP1[sup]high[/sup]CD206[sup] +[/sup][/font][font=宋体]促肿瘤巨噬细胞的活化，最终抑制结直肠癌肝转移。研究从调控[/font][font=&]TME[/font][font=宋体]的角度，特别是抑制[/font][font=&]circ-0034880[/font][font=宋体]的生物合成和细胞外囊泡的生成，首次揭示了人参皂苷[/font][font=&]Rb1[/font][font=宋体]在肿瘤防治领域的特殊作用，为今后的临床药物转化奠定了坚实的基础。 [size=15px][b]1、富含Circ-0034880的血浆EV与CRLM相关[/b][/size][font=宋体]基于细胞外囊泡在肿瘤转移中的重要作用，作[/font][font=宋体]者首先人类血液外泌体数据库、GSE159669数据集，以及临床血浆细胞外囊泡样本发现[/font][size=15px]一个环状RNA circ-0034880在结直肠癌肝转移患者中具有更高的表达水平，表明该环状RNA与结直肠癌的肝转移密切相关[/size] [size=15px][b]2、富含Circ-0034880的TEV在体内促进CRLM[/b][/size][size=15px]为了进一步研究circ-0034880富集的TEVs对CRC肝转移的体内影响，作者通过体内示踪实验发现了肿瘤细胞MC38来源的EVs在肝中高度积累。体内注射肿瘤细胞MC38来源的EVs可以促进肝转移，而缺失circ-0034880的EVs却丧失其促肝转移的作用，结果表明EVs依赖于其携带的circ-0034880发挥作用[/size] [size=15px][b]3、Circ-0034880富集的TEV激活肝脏转移前微环境中的CD206+促肿瘤巨噬细胞[/b][/size][size=15px]为了全面评估circ-0034880富集的TEV对肝脏转移前微环境的影响，研究人员对小鼠持续进行TEV注射和肿瘤细胞注射，建立了一个肝转移小鼠模型，多重免疫荧光分析显示TEV处理促进CD206 +促肿瘤巨噬细胞在转移前肝脏中的显著浸润，且circ-0034880表达水平与CD206 +促肿瘤TAM浸润之间存在正相关性 [/size][size=15px][/size][size=15px][b]4、Circ-0034880富集的TEV通过激活CD206 +促肿瘤巨噬细胞促进CRC细胞迁移[/b][/size][size=15px]由于有多项报道显示活化的巨噬细胞对CRC细胞迁移有促进作用，作者进一步研究利用示踪实验发现TEV可以携带circ-0034880被巨噬细胞所吸收。此外，功能实验表明富含circ-0034880 的TEV可以促进CD206+促肿瘤巨噬细胞的活化，并且携带circ-0034880的TEV的巨噬细胞上清会显著促进肿瘤细胞的迁移 [/size][size=15px][b]5、Circ-0034880富集的TEV促进SPP1[sup]high[/sup]CD206 +促肿瘤巨噬细胞的激活[/b][/size][size=15px]为了探究携带circ-0034880的TEV对CD206+促肿瘤巨噬细胞的激活机制，研究人员对TEV处理的巨噬细胞进行了转录组数据分析，进一步通过体外基因和蛋白检测和体内IF实验验证了巨噬细胞中SPP1是其调控的靶点，这些发现表明circ-0034880富集的TEV促进了SPP1[sup]high[/sup] CD206 +促肿瘤巨噬细胞的激活。鉴于已知circRNA可作为miRNA海绵发挥作用，作者分析了circ-0034880靶向的miRNA和SPP1结合的miRNA，发现了有2个miRNA重叠：miR-200a-3p和miR-141-3p。结合实验证明这两个miRNA可结合circ-0034880和SPP1，表明 circ-0034880和SPP1竞争结合miRNA，使SPP1不被miRNA所抑制。SPP1是巨噬细胞活化的关键蛋白，因此，研究结果表明TEV释放的circ-0034880通过保护SPP1免受miR-200a-3p和miR-141-3p介导的降解来提高巨噬细胞中SPP1的表达，促进SPP1[sup]high[/sup]巨噬细胞亚群增加 [/size][size=15px][b]6、人参皂苷Rb1给药可通过阻止富含circ-0034880的TEVs介导SPP1[sup]high[/sup]CD206+促肿瘤巨噬细胞的激活来阻止CRC细胞迁移[/b][/size][size=15px]鉴于circ-0034880的重要作用，下调其表达可以作为抑制癌症肝转移的策略，于是作者对103种天然药物进行了筛选，发现4种天然产物（人参皂苷Rb1、异鼠李素、山奈酚和槲皮素）对该circ-0034880的抑制作用最强，其中人参皂苷Rb1具有更强抑制作用。同样人参皂苷Rb1预处理的肿瘤细胞来源的TEV，其作用于巨噬细胞后下游的SPP1的蛋白表达造成下调作用，后续对结直肠癌细胞迁移能力下降，效果类似于沉默circ-0034880。总之，研究结果表明人参皂苷Rb1给药可通过抑制富含circ-0034880的TEV介导的SPP1[sup]high[/sup] CD206+促肿瘤巨噬细胞的激活来阻止CRC细胞迁移 [/size][size=15px][b]7、人参皂苷Rb1直接与QKI蛋白结合，抑制circ-0034880的生物合成[/b][/size][size=15px]为了确定影响circ-0034880表达的Rb1的直接靶点，作者进行了DARTS实验筛选出151种差异表达蛋白，其中一个蛋白QKI被报道与调控前mRNA剪接和促进circRNA生物合成。研究者接下来采用CETSA分析来验证了QKI和Rb1的结合，证实了Rb1能够显著增加QKI的热稳定性。进一步采用SPR分析验证了Rb1与QKI之间的很强的结合亲和力，通过分子对接预测了结合模式。此外，敲低QKI能够显著抑制该circRNA的表达。研究结果表明Rb1直接与QKI蛋白结合，抑制circ-0034880的生物合成[/size] [size=15px][/size][size=15px][b]8、[/b][/size][size=15px][b]人参皂苷[/b][/size][size=15px][b]Rb1给药通过阻止circ-0034880富集的TEV介导SPP1[sup]high[/sup]CD206+促肿瘤TAM的激活来抑制CRLM[/b][/size][size=15px]最后，作者验证了Rb1 给药的[i]体内[/i]效果，发现与单独使用TEV相比，使用Rb1预处理的TEV给药组的肝转移显著减少，与直接沉默circ-0034880的效果非常相似。然而，在沉默circ-0034880的情况下，使用Rb1预处理的TEV给药对肝转移的影响很小。接下来，作者探讨了Rb1对肝转移中CD206+促肿瘤TAM浸润的影响，发现在Rb1预处理的TEVs给药组中，SPP1表达显著下调，类似于直接沉默circ-0034880的效果。然而，在沉默circ-0034880的前提下，相应肝转移中的SPP1表达受到Rb1预处理的TEVs给药的影响最小。总之，体内功能实验证明Rb1预处理的肿瘤细胞来源的TEV失去了促进癌症肝转移的作用[/size][/font][/size]