结构变化

单克隆抗体(mAb)是制药行业增长最快的治疗方法之一，mAb的高阶结构(HOS)影响药物与靶标的结合特异性，从而影响治疗效果和副作用。若储存而导致HOS发生变化，例如蛋白质错误折叠和聚集，会导致稳定性降低、功效丧失或可能的免疫原性。因此，监测HOS对保证mAb疗法的有效性和安全性至关重要。X射线晶体学和核磁共振(NMR)光谱可以提供原子级分辨率，但存在费时费样品的缺点；生物物理技术，如差示扫描量热法(DSC)、动态光散射(DLS)、荧光光谱、红外(IR)光谱和圆二色(CD)光谱只能提供低分辨率的整体构象。焦碳酸二乙酯(DEPC)作为亲电子试剂能够修饰溶剂可接近的亲核侧链（Cys、His、Lys、Thr、Tyr、Ser）和蛋白质的N末端，这些残基产生的羧基化产物具有+72.021Da的质量转移，经过蛋白水解消化、液相色谱分离和串联质谱分析后，可以识别和半定量特定的蛋白质修饰位点。将一种条件（例如天然）与另一种条件（例如加热）进行比较时，特定残基处共价标记程度的变化可用于探测蛋白质的HOS变化（图1）。在这篇文章中，作者使用DEPC共价标记联用质谱，以利妥昔单抗作为单抗药物的模型，以期在远低于mAb治疗药物熔点的温度下能够特异性检测细微HOS变化，并通过活性测定进行验证。图1. DEPC 标记与质谱联用分析单抗药物结构的流程在通过共价标记研究热应力（heat stressed）利妥昔单抗之前，作者使用CD光谱、荧光光谱和动态光散射(DLS)来识别加热对蛋白质结构的干扰。发现当在低于其熔点的温度下加热利妥昔单抗4小时时，这三种技术在45°C或55°C时无法检测到显著的结构变化，而在65°C时仅显示出轻微的变化。随后作者团队使用DEPC CL-MS探测利妥昔单抗的细微结构变化。在45°C压力下的利妥昔单抗样品中发现DEPC标记水平的变化较少，大多数变化是由于蛋白质受热去折叠导致的标记增加（图2），且可变区的变化远少于恒定区。超过70%的标记变化发生在Tyr、Ser和Thr残基处，而发生在His和Lys残基处的标记变化始终小于20%。标记变化表明，45°C时的结构变化主要是局部微环境的变化，而非溶剂可及性差异显著的大结构变化，也就是说修饰位点分散在整个蛋白质结构中，而不是集中在蛋白质的某些区域。图2. 45°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。活性测定能反映一定程度的结构变化对利妥昔单抗活性的影响，从而验证DEPC标记结果。桥接ELISA的结果表明，在预热至45°C后，利妥昔单抗的Fc结合活性没有显著变化（图3a），Fc区域的CDC活性估计在45°C热应激后保持不变（图3b），利妥昔单抗的Fab结合活性估计与对照样品没有差异（图3c）。活性测定结果表明蛋白质在45°C时没有发生显著的结构变化。在Fab和Fc区域中标记变化的残基数量相对较少，主要标记对局部微环境变化更敏感的Tyr、Ser和Thr残基。修饰位点分散在整个蛋白质中，对Fab和Fc区域的构象几乎没有影响，与共价标记质谱联用的测定结果相吻合。图3.使用单抗活性测定验证CL-MS实验揭示的结构变化。Fc区的结构完整性通过(a)测量Fc与捕获抗体结合的利妥昔单抗桥接ELISA和(b)测量补体依赖性细胞毒性的Alamarblue测定来评估。Fab区域的结构完整性通过(c)Raji细胞下拉试验评估，测量Fab与B细胞CD20抗原的结合。55°C加热4h后利妥昔单抗所有结构域的残基修饰程度都发生了显著的变化，尤其是Fab区域的VH和VL结构域。（图4）加热至55°C时，His和Lys残基处发生的标记变化几乎是45°C的两倍，表明蛋白质在这些区域展开；Fab区域标记水平发生显著变化，特别是在VH、VL和CL域。这表明利妥昔单抗的Fab区域存在局部结构变化，据报道这也是IgG1分子中对热应激最敏感的区域。Fc区域中没有观察到类似的发生标记变化的残基聚集，Tyr、Ser和Thr处的大多数标记变化为中度或高度变化，这些结果表明蛋白质拓扑结构可能发生变化。图4. 55°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。尺寸排阻色谱(SEC)测量表明在65°C加热条件下存在高分子量物质。将DEPC CL-MS方法应用于65°C热应力的利妥昔单抗后，发现所有利妥昔单抗结构域的标记发生显著变化（图5），主要体现为标记的减少，这可能是因为蛋白质聚集。利妥昔单抗的Fab和Fc区均发现标记减少的残基簇，活性测定结果显示Fc结合和CDC活性的降低（图3），说明了Fc区特别是CH3结构域的标记变化，与DEPC标记结果一致。图5. 65°C 热应力 4 h 后 DEPC修饰程度的变化。饼图表示在利妥昔单抗的每个结构域内标记变化显著的修饰残基比例。红色代表标记增加，而蓝色代表减少。条形图表示共价标记变化程度低 (L)、中 (M) 和高 (H)的残基数量。总结DEPC标记技术的结构分辨率和灵敏度足以探测细微的蛋白质构象变化，该技术与质谱联用可在低于Tm的温度下揭示利妥昔单抗中的细微HOS变化，与经典的生物物理技术互补。总体而言，鉴于CL-MS简便、灵敏的特点，该方法将适用其他抗体药物的结构研究。

p　　北京市环境保护局局长方力29日透露，2017年北京环境质量得到改善，但大气污染源结构发生较大变化，污染主体已由大中型污染源向移动源、生活源转变，治理难度加大。/pp　　北京市第十五届人大常委会第三次会议于29日至30日在京举行。方力当天作北京市2017年环境状况和环境保护目标完成情况的报告。/pp　　2017年北京环境治理得到进一步改善。去年北京PM2.5年度浓度为58微克/立方米，同比下降20.5%。优良天数为226天，同比增加28天。/pp　　不过方力坦言，由于超大城市污染排放总量大、排放区域集中，加之整体区域环境容量有限，环境质量与国家标准要求、民众对美好生活的需求相比，仍有较大差距。/pp　　他介绍，随着产业结构、能源结构的调整和治理的不断深入，大气污染源结构发生较大变化，污染主体已由大中型污染源向移动源、生活源转变，点多、量大、面广，治理难度加大。他说，同时，北京水资源紧缺、水环境质量较差的局面没有根本转变，下游水体水质普遍较差 京津冀区域以重化工为主的产业结构、以煤炭为主的能源结构、以公路运输为主的交通结构短期内不会根本改变，北京的环境治理依然任重道远。/pp　　针对2018年的工作，方力称“要坚决打好蓝天保卫战。”他说，将以进一步降低PM2.5浓度为目标，以治理氨氧化物和挥发性有机物等污染物为重点，推进多种污染物协同减排 把高排放重型柴油车管控作为重中之重 更突出精细化管理 研究制定重点行业大气污染物排放标准等。/pp　　谈及水污染治理，方力介绍，将开展水资源消耗总量和强度双控，增加全市再生水利用量 加强饮用水源保护。/pp　　他说，要推进土壤和固废污染防治 加快推进垃圾处理设施建设，力争垃圾分类示范区覆盖率达30%。/pp　　“将加大体制改革力度。”方力说，将制订危险废物污染环境防治条例，修改大气、水污染防治条例，启动生态保护红线地方立法论证，开展移动源污染防治地方立法前期研究 出台生态环境损害赔偿制度。/p

从高温热浪、暴雨洪灾到飓风山火、极端寒流，全球极端天气事件发生的频率持续增加。气象专家指出，气候变化是导致极端天气事件越来越频繁的主要原因。国际社会应继续携手努力，完善极端天气预警机制，大幅减少温室气体排放，共同应对气候变化。　新年伊始，多个国家气象部门发布的报告显示，过去一年是这些国家有气象记录以来最热的一年。世界气象组织不久前发布的《2022年全球气候状况》临时报告指出，2022年，高温、干旱和洪水等极端天气灾害对全球数百万人造成影响，带来的经济损失达数十亿美元。极端天气事件频发，造成严重损失国际自然灾害常设观测网站2022年共记录全球891起极端天气灾害事件。这些事件造成的人员伤亡和经济损失“略高于过去10年的平均水平”。慕尼黑再保险集团表示，2022年是自然灾害损失赔付额最高的年份之一，气候变化正使极端天气变得更加频繁。法国气象局本月初发布公告指出，2022年法国平均气温达14.5摄氏度，是法国有气象记录以来最热的年份。去年法国大部分月份平均气温都比常年同期偏高，降水量明显偏少，导致严重干旱。异常的高温和干旱让该国西南部吉伦特省等多地发生森林火灾，6.2万公顷森林被烧毁，是过去10年平均水平的6倍。欧盟下属的哥白尼气候变化服务局年初发布报告说，2022年是欧洲有记录以来第二热的年份。去年夏天异常高温天气波及众多欧洲国家。西班牙国家气象局表示，2022年是西班牙有记录以来最热的一年，全年平均气温接近15.5摄氏度。英国气象局证实，2022年英国平均气温首次突破10摄氏度，成为该国有记录以来最热的一年。去年夏天最高气温首次突破40摄氏度，一些地方甚至出现铁轨变形、机场跑道被晒化的情况。一些国家还遭遇暴雨洪灾等极端天气。世界气象组织指出，去年8月巴基斯坦由于季风降雨导致严重洪灾和山体滑坡。同一时间，乍得也遭遇前所未有的洪灾，超过34万人受到影响。南非东部去年4月遭遇近60年来最强降水，人员伤亡惨重，超4万人无家可归。在北美地区，冬季风暴给美国、加拿大多地交通、供电等造成严重影响。据美国有线电视新闻网报道，2022年美国共发生龙卷风、高温、飓风、洪水等灾害18次。美国国家海洋和大气管理局的报告指出，2022年极端天气在美国累计造成至少1650亿美元经济损失及大量人员伤亡。采取更多措施，减少温室气体排放世界气象组织秘书长塔拉斯表示，气候变化增加了极端天气发生的频率和严重程度。联合国政府间气候变化专门委员会去年发布报告指出，人类活动引发的气候变化造成了更频繁、更严重的极端天气事件。随着人类活动导致的全球变暖加剧，极端天气事件发生的频率将进一步增加。世界气象组织在《2022年全球气候状况》临时报告中指出，2022年海平面高度再创新高，自2020年1月以来已上升近10毫米。美国《科学》期刊本月初发布的研究报告显示，按照目前全球平均气温上升趋势推算，到本世纪末全球近七成陆地冰川将完全消融。冰川加速融化对生态环境及生物多样性带来负面影响。法国国家科学研究中心研究员克里斯托夫卡苏指出，极端天气频发证明了人类活动对气候的影响，温室气体排放越多，灾害发生的频率就越高。塔拉斯表示，2022年发生的极端天气事件再次警示人们应对气候变化、提升抗风险能力的紧迫性，必须采取更多措施减少温室气体排放，并对气候进行更好监测。为应对气候变化，迄今已有130多个国家和地区提出了碳中和或净零排放目标，部分国家制定了应对气候变化的法律或国家战略。其中，中国已宣布将力争在2030年前实现碳达峰、2060年前实现碳中和，并构建起碳达峰碳中和“1+N”政策体系。中国积极调整产业结构、能源结构、交通运输结构，推行绿色低碳生产生活方式，超额完成到2020年碳排放强度比2005年下降40%—45%的目标。法国也承诺到2030年减排40%，加大对清洁能源的投资，优化能源结构，推动本国能源转型。加强合作，向发展中国家提供更多支持世界气象组织强调，构建气候变化风险早期预警体系是更好预测极端天气事件的关键之一。然而研究显示，全球尚有一半国家没有预警系统，拥有监管框架并将预警与应急计划联动实施的国家更少，特别是最不发达国家和小岛屿发展中国家仍然无法获得早期预警系统提供的预警信息。塔拉斯表示，2023年世界气象组织将聚焦早期预警系统的构建，增加对全球气候基础观测系统的投资和建设，提高应对极端天气的能力。去年11月《联合国气候变化框架公约》第二十七次缔约方大会期间，联合国秘书长古特雷斯宣布一项全民预警行动计划，将在2023年至2027年间投入31亿美元专项资金，实现地球上每个人都能得到预警系统的保护。联合国环境规划署发布的《2022年排放差距报告》显示，2022年提交的国家自主贡献只减少了0.5千兆吨的二氧化碳当量。报告指出，要将全球升温控制在1.5摄氏度，到2030年的排放量必须比现行政策下的排放量减少45%。联合国环境规划署执行主任英厄安诺生表示，加强全球应对气候变化的能力，绕不开发达国家向发展中国家提供资金和技术支持等问题。在《联合国气候变化框架公约》第二十七次缔约方大会上，各方同意建立损失与损害基金，向受气候变化影响最严重的国家提供财政援助，基金形式、出资国家、分配方式、援助对象等关键问题则留到2023年继续谈判。世界经济论坛日前发布的《2023年全球风险报告》将气候变化视为全球面临的最严重的长期风险。世界经济论坛执行董事萨迪娅扎希迪表示，各国需要共同努力，以正确、有效的方式应对风险，“合作和团结至关重要”。卡苏表示：“通过向发展中国家提供财政援助来减少气候变化造成的不平等，对发达国家来说不仅是一种责任，也是国际社会团结的表现。”