化学链式反应

聚合酶链式反应 (The polymerase chain reaction ,PCR) 彻底改变了 DNA 分析和扩增的方式。自 20 世纪 80 年代推出以来，PCR 已发展成为分子生物学中最重要的技术之一。它是一种快速、定向扩增特定 DNA 序列的方法，基于 DNA 变性、引物杂交和耐热 DNA 聚合酶合成 DNA 的原理。PCR 在科学和医学领域有着广泛的应用。在基因表达分析中，它可用于量化特定基因的表达并研究其调控。在基因分型中，PCR 能够识别基因变异并将基因型分配给特定性状或疾病。在法医 DNA 分析中，PCR 还可用于放大 DNA 的微小痕迹，并利用它们来识别嫌疑人或分析亲属关系。PCR也用于传染病的诊断。这样可以快速、准确地检测病毒或细菌等病原体，从而实现早期诊断和针对性治疗。在产前诊断中，PCR 还用于识别未出生婴儿的遗传异常或染色体疾病。PCR 基础知识PCR 由几个步骤组成。在第一步变性中，双链 DNA 通过加热分离，形成单链。当溶液冷却时，短的合成 DNA 引物特异性结合两条单链并标记要扩增的区域（退火）。在随后的延伸过程中，DNA 聚合酶与标记位点结合并沿着模板合成新的 DNA 链。该酶通过添加核苷酸（DNA 的组成部分）来激活。通过重复变性、退火和延伸步骤，复制的 DNA 片段数量可以呈指数增长。因此，经过多次PCR循环后，原始DNA序列可以被扩增成数千或数百万个拷贝。PCR 可以通过多种方式进行修改，以适应特定的应用，例如，通过使用特定的酶或标记。PCR 具有许多优点，使其成为现代分子生物学中不可或缺的工具。这里首先要提到的是高灵敏度和低材料要求。PCR 可以扩增最少量的 DNA 或 RNA，从而可以非常灵敏地检测病原体或特定序列。为此只需要少量的 DNA 或 RNA，这简化了采样和样品制备，并减少了所需起始材料的数量。通过使用与精确定义的 DNA 或 RNA 序列结合的特异性引物，PCR 可以非常具有特异性并选择性地扩增目标材料。快速获得结果；扩增过程通常可在数小时内完成。自动化 PCRPCR 的最大优势之一是其自动化能力，可以更轻松地检查大量样本并减少相关工作量。自动化 PCR 包括自动化系统和仪器执行的所有经典子步骤。所需试剂（DNA 模板、引物、DNA 聚合酶、核苷酸和缓冲溶液）的精确配量和添加是在受控环境中进行的，以最大程度地减少污染。热循环仪用于精确控制温度循环，包括变性（将 DNA 分离成单链）、退火（引物与目标 DNA 结合）和延伸（由引物合成互补 DNA 链）的步骤。 DNA 聚合酶）。现代自动化 PCR 系统可以实时检测和评估 PCR 结果。这可以使用与特定 DNA 序列反应的荧光探针或染料来完成。该系统在 PCR 过程中检测荧光信号，以确定目标 DNA 的存在和定量。使用特殊软件分析从自动 PCR 获得的数据。该软件可以解释 PCR 结果、计算扩增曲线、确定阈值以及对目标 DNA 进行定量。市场上有各种各样的自动化 PCR 仪器，每种仪器都提供不同的功能和功能。Thermo Fisher Scientific（美国沃尔瑟姆）是提供各种自动化 PCR 系统的领先供应商之一，其中包括 Veriti Dx 96 孔热循环仪以及 Applied Biosystems QuantStudio 3 和 5 实时 PCR 系统。这些系统具有从实时 PCR 到数字 PCR 的各种功能，可用于研究实验室和临床环境。Bio-Rad（美国赫拉克勒斯）也是著名的实验室仪器制造商，提供自动化 PCR 系统，例如 CFX Opus 实时 PCR 检测系统和 QX200 微滴式数字 PCR 系统。除此之外，这些系统能够实时或以数字液滴格式进行精确的 DNA 扩增和检测。Roche Diagnostics（瑞士巴塞尔）提供用于实时 PCR 的 LightCycler 仪器。这些仪器可快速扩增和检测 DNA 序列，广泛应用于分子诊断。Illumina（美国圣地亚哥）是新一代测序 (NGS) 领域的领先公司，其产品组合中拥有自动化 PCR 系统。MiseqDx 仪器是一款自动测序仪，可在一个集成系统中实现基于 PCR 的扩增和 DNA 测序。为了进一步提高自动化程度，可以通过提取、清洗和选择性片段化来制备 DNA。Maxwell 仪器（Promega，麦迪逊，美国）等适合此目的，因为它能够自动提取和纯化可用于 PCR 的核酸。QIAcube 自动化系统（Quiagen，希尔登，德国）还可以自动纯化 DNA 样品。还有许多其他制造商提供自动化 PCR 系统。该领域的市场正在迅速发展。因此，在选择系统时，建议考虑具体要求、所需功能以及与计划应用程序的兼容性。自动化 PCR 系统应具有几个重要特性，以实现高效可靠的 PCR 结果。这首先包括精确的温度控制。它对于正确实施 PCR 各个步骤（变性、退火和延伸）至关重要。该系统应提供对温度循环的精确控制并保持严格的耐受温度范围。自动化 PCR 系统必须提供可靠的检测技术来测量 PCR 结果。这可以通过荧光探针、染料或其他检测方法来实现。检测的高灵敏度、特异性和重现性对于准确的 PCR 结果至关重要。质量保证和污染控制机制还应结合起来，以确保结果的准确性和可靠性。这可以通过使用阴性对照、自动移液、封闭反应管或其他方式来实现。其他要求包括灵活性和适应性。该系统应支持不同的 PCR 格式（例如实时 PCR、数字 PCR 或等温 PCR），并提供设置和定制不同 PCR 反应和方案的可能性。根据应用，必须保证与常用试剂和耗材的适当兼容性。与不同 PCR 试剂盒制造商和试剂的兼容性是能够使用各种测定和方案的优势。自动化 PCR 系统还应该具有可扩展性，以适应 PCR 反应的通量以满足要求。它们应该提供并行处理大量样品以实现高通量的可能性。用户友好的软件具有直观的用户界面，是易于操作的标准配置。该软件应该能够对 PCR 方案进行编程、监测反应进度并分析数据。通常内置用于量化、阈值和分析扩增曲线的强大数据分析功能。与手动实施相比，自动 PCR 具有多种优势。通过使用热循环仪和 PCR 机器人等自动化系统可以提高 PCR 的准确性和重现性。温度循环的精确控制和试剂的准确剂量可以提高效率并减少错误和污染。此外，自动化允许同时进行多个 PCR 反应，从而节省大量时间。自动化还可以实现复杂的 PCR 方案，例如多重 PCR [1] 和巢式 PCR [2]，广泛应用于研究和诊断。图 1：自动 PCRPCR 技术的最新发展 尽管 PCR 是分子生物学中的一项成熟技术，但它仍在不断得到进一步发展，以提高效率、灵敏度和应用领域。与经典 PCR 相比，等温 PCR 保持恒定温度，这使得过程更容易、更快 [3]。环介导等温扩增 (LAMP) 等等温 PCR 技术无需热循环仪即可扩增 DNA。这些方法用于快速诊断传染病和遗传性疾病。此外，数字PCR（dPCR）的发展进一步扩大了PCR的可能性[4]。DNA 不是在单个反应中扩增，而是被分解为数千或数百万个单独的反应。对结果进行统计分析可以精确确定 DNA 拷贝的绝对数量。dPCR 可用于检测癌症中的微小残留病、测定基因拷贝数以及准确测定病毒载量等应用。数字液滴 PCR (ddPCR) 是数字 PCR 的一种变体，其中 PCR 反应分为数千或数百万个水滴 [5]。每个液滴都含有一个或几个 DNA 拷贝。通过分析阳性和阴性液滴可以精确确定DNA拷贝的绝对数量。ddPCR 具有高灵敏度、精确度和重现性，可用于非侵入性产前诊断和癌症液体活检等应用。小型便携式 PCR 系统的开发使得 PCR 可以在实验室外使用。即时 PCR 设备用于医疗诊断，特别是在偏远地区或快速诊断传染病。这些系统易于使用，不需要复杂的基础设施，并能在短时间内提供可靠的结果。PCR 和 NGS 技术的结合彻底改变了 DNA 测序 [6]。通过使用基于PCR的方法，例如测序前的PCR扩增，可以有针对性地扩增和分析特定的DNA序列。这样可以识别突变、遗传变异，并对 DNA 序列进行详细研究。参考文献[1] Hasan, M. R., Kalikiri, M. K. R., Mirza, F. (2021). Real-Time SARS-CoV-2 Genotyping by High-Throughput Multiplex PCR Reveals the Epidemiology of the Variants of Concern in Qatar. International Journal of Infectiuos Diseases. 112, pp. 52-54. DOI: 10.1016/j.ijid.2021.09.006.[2] Green, M.R. (2019). Nested Polymerase Chain Reaction (PCR). Cold Spring Harbor Protocols. DOI:10.1101/pdb.prot095182.[3] Asielle, P. J., Baeumer, A. J. (2012). Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab Chip, 11, pp. 1420-1430, DOI:10.1039/C0LC00666A.[4] Morley, A.A. (2014). Digital PCR: A brief history, Biomolecular Detection and Quantification, 1(1), pp. 1-2, DOI: 10.1016/j.procbio.2012.11.007.[5] Kojabad, A. A., Farzanepour, M. Galeh, H. E. G. et al. (2021). Droplet digital PCR for viral DNA/RNA, current progress, challenges, and future perspectives. Journal of Medical Virology, DOI: 10.1016/j.bdq.2014.06.001.[6] Ladetto, M., Brüggemann, M., Monitillo, L. et al. (2013). Next-generation sequencing and real-time quantitative PCR for minimal residual disease detection in B-cell disorders, Leukemia, 28, 1299-1307, DOI: 10.1038/leu.2013.375.关于作者Kerstin ThurowCenter for Life Science Automation, Universität Rostock, Rostock, DeutschlandRostock, Germany教授、博士、工程师。于 1995 年在慕尼黑路德维希马克西米利安大学获得博士学位。1999 年，她取得了测量与控制工程的资格。同年，她被任命为罗斯托克大学工程学院“实验室自动化”教授。自 2004 年以来，她一直担任罗斯托克大学“自动化技术/生命科学自动化”系主任，并担任罗斯托克大学生命科学自动化中心主任。她的研究主题包括生命科学过程的自动化、机器人技术、移动机器人技术以及系统集成和系统工程。原文：Automation of Polymerase Chain Reaction (PCR)，Wiley Analytical Science newsletter，8 February 2024供稿：符 斌

一、实验目的该方案旨在开发一种基于导电性调节的双极电化学发光（The bipolar electrode based ECL，BPE-ECL）传感平台，用于无指示剂的均相生物分析。该平台通过导电性生物传感技术与ECL报告系统的结合，实现了在无需外源电活性指示剂的情况下进行目标检测。研究以miRNA-21的检测为示范，探索该方案的可行性和应用前景。二、实验使用的仪器设备和耗材试剂1. 仪器设备超微弱发光分析仪：BPCL-2，结合光电倍增管（PMT）操作电压为-800V，用于测量ECL发光强度。电化学工作站：用于施加电位。电导率仪：用于测量溶液的电导率。电泳仪：用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），验证核酸杂交链式反应（HCR）。生物分子成像仪：用于电泳结果成像。2. 耗材试剂聚二甲基硅氧烷（PDMS）：用于制作传感和报告池。Ru(bpy)32+和TPrA：作为ECL检测体系的核心试剂。氯金酸（HAuCl4）：用于电极金属化处理。合成核酸：由Sangon Biotech提供，包括探针DNA、H1、H2及目标miRNA-21等。人乳腺癌细胞：用于miRNA-21的实际应用检测。超纯水：18.2 MΩcm，作为所有实验的溶剂。三、实验过程1. BPE传感器的制作(1). ITO玻璃板的准备：从供应商处采购电阻小于6Ω/平方的ITO玻璃板，并在其上制作导电BPE，确保传感池包含BPE的阴极和驱动电位的阳极，而报告池包含BPE的阳极和驱动电位的阴极。(2). 电沉积金：为了提高导电性，分别在BPE的阴极和驱动电位的阴极上进行金电沉积。2. 杂交链式反应（HCR）的进行(1). 反应混合：在超纯水中混合探针DNA、H1和H2，浓度分别为0.5 μM、5 μM和5 μM。(2). 目标miRNA-21的添加：将不同浓度的miRNA-21加入混合物中，37°C孵育2小时以进行HCR反应。3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）验证：(1). 电泳条件：在TBE缓冲液（1×）中，恒定电压80V，室温下进行2小时电泳。(2). 成像分析：使用生物分子成像仪拍摄凝胶，以验证探针DNA、H1和H2的杂交情况。4. BPE-ECL传感检测(1). 准备工作溶液：在报告池中加入200μL含有5mM Ru(bpy)32+和5mM TPrA的PBS缓冲液（0.1 M，pH 7.0），在传感池中加入HCR孵育后的样品。(2). ECL测量：使用循环伏安法，电位范围为1.0-4.5V，扫描速率为100 mV/s，进行ECL测量。每个样品测量三次，计算标准偏差。四、实验结果与讨论1. HCR反应和导电性变化的验证(1). PAGE分析（图1A）：短核酸（探针、H1、H2）在低分子量位置显示荧光带，而miRNA-21诱导的核酸聚合物在高分子量位置显示。这验证了目标miRNA-21触发了探针、H1和H2的杂交反应。(2). 导电性测量（图1B）：混合短核酸后溶液的导电性显著增加，而加入miRNA-21后，导电性显著下降。这表明生成的长核酸聚合物导电性较差。(3). ECL测量（图1C）：ECL强度在短核酸（22 bp）溶液中显著高于长核酸（1250 bp），进一步验证了导电性对BPE-ECL系统的重要影响。(4). ECL响应的验证（图1D）：相较于无miRNA-21存在的情况（曲线g），miRNA-21存在时ECL响应显著降低（曲线h），因为miRNA-21诱导的HCR生成了导电性较差的核酸聚合物。图1. (A) PAGE分析: (a-c通道) 探针、H1、H2；(d通道) H1 + H2；(e通道) 探针 + H1 + H2；(f通道) 探针 + H1 + H2 + miRNA-21。(B) 对应PAGE相同条件下的导电性比较。(C) 5 μM短链（22 bp）和长链（1250 bp）核酸溶液的ECL响应比较。(D) BPE-ECL生物测定在无miRNA-21 (g) 和有1 pM miRNA-21 (h) 情况下的ECL响应。2. 分析条件的优化(1). 探针浓度（图2A）：ECL强度差值（ΔECL）随着探针浓度的增加而增加，在浓度超过0.5 μM后达到平台期。因此，选用0.5 μM作为最佳探针浓度。(2). H1/H2浓度（图2B）：随着H1/H2浓度的增加，ΔECL响应持续增强，在5 μM时达到饱和，表明5 μM为最佳H1/H2浓度。(3). 温度（图2C）：ΔECL响应随着温度升高至37°C后增加，随后略有下降，表明最佳反应温度为37°C。(4). 反应时间（图2D）：ΔECL响应随HCR反应时间的延长而增加，在120分钟后达到最大，选择120分钟作为最佳反应时间。图2. (A) 探针浓度，(B) H1/H2浓度（[H1]:[H2] = 1:1），(C) 温度，和 (D)反应时间对ΔECL响应的影响。所有实验中的miRNA-21浓度均为1 pM。3. 传感系统的性能评估(1). 检测限与线性范围（图3）：不同浓度miRNA-21的ECL响应如图3A所示。ECL强度与miRNA-21浓度的对数呈良好线性关系（图3B），线性范围为1 fM至10 nM，检测限为0.33 fM。图3. (A) 不同浓度miRNA-21的ECL响应: (a&minus i) 空白, 1 fM, 10 fM, 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM。(B) ECL强度与miRNA-21对数浓度之间的线性关系。(2). 选择性（图4A）：高结构类似物（miRNA-122、miRNA-141、miRNA-155）的检测结果表明，BPE-ECL传感系统对miRNA-21具有良好的特异性。(3). 稳定性和重复性（图4B, 4C）：ECL信号在八次重复测量中稳定，RSD为2.56%，三种不同浓度miRNA-21的RSD分别为3.2%、2.4%和1.4%，表明系统具有良好的稳定性和重复性。(4). 实际应用（图4D）：检测不同数量MCF-7细胞裂解液中的miRNA-21，ECL信号随细胞数量增加而下降，验证了该传感平台在临床样品检测中的应用潜力。图4. (A) 不同miRNA类似物的ECL响应，miRNA-122、miRNA-141和miRNA-155浓度为10 pM，miRNA-21浓度为1 pM。 (B) BPE-ECL生物传感平台的稳定性。 (C) BPE-ECL传感器对不同浓度miRNA-21响应的重现性。 (D) 不同数量MCF-7细胞裂解液的ECL响应。五、结论本方案提出了一种基于导电性调节的BPE-ECL生物传感平台，该平台利用目标miRNA-21诱导的HCR反应生成长链核酸聚合物，导致传感池导电性降低，进而减少报告池的ECL信号输出。该平台具备传统BPE-ECL传感器的优点，通过物理分离传感和报告反应有效避免了干扰，且无需外源电活性指示剂。该方案简单、灵敏、快速，并在实际样品检测中表现出良好的应用前景。未来，该方案有望进一步应用于包括DNA、小分子、蛋白质、细胞和细菌等多种目标的定量和定性检测。*因学识有限，难免有所疏漏和谬误，恳请批评指正*资料出处：免责声明:1.本文所有内容仅供行业学习交流，不构成任何建议，无商业用途。2.我们尊重原创和版权，如有疏忽误引用您的版权内容，请及时联系，我们将在第一时间侵删处理！

“碳中和目标从化学本质看，就是碳和氢的平衡和循环。”在近日举行的香山科学会议第746次学术讨论会上，中国科学院院士、华东师范大学石油化工科学研究院教授何鸣元表示，工程热化学是实现碳中和目标的重要科学技术基础。　　此次会议上，专家指出，工程热化学领域科技创新是推动绿色低碳发展、实现循环经济的必由之路，对实现“双碳”目标具有重要意义。　　占关键工业行业化学反应80%　　“相对于光、电诱发的化学反应，热诱发、热驱动的化学反应统称为热化学反应。”沈阳化工大学特色资源化工与材料教育部重点实验室主任许光文介绍，这种化学反应紧密关联热生成、热传递、热利用，往往以高温为特点，可能占据能源、冶金、材料、环境等关键工业行业化学反应的80%。　　据了解，经典意义的热化学转化有3类过程，即焚烧、气化和热解。其自由基链式反应的本质特征使气液固3种相态的物质均可发生热化学反应。从工业视角分析，规模化和经济性是热化学转化要求的重要特点。　　“碳能源包括天然气、石油、生物质和煤，还可以计入二氧化碳。”何鸣元从化学的角度分析道，碳能源的有效利用在于碳和氢的平衡，其中必然包括一系列的分子断键与重构。无论从大分子裂解生成较小的分子，或者从小分子构建成较大的分子，热化学转化在很多过程中都可以发挥重要甚至不可替代的作用。　　许光文提到，一方面，各种能源燃料转化、矿产资源加工、废弃物无害化、各类动力获取及爆轰等，都依赖热化学反应形成的技术、装备及工程；另一方面，通过热化学反应途径排放的二氧化碳占据了人类活动总碳排放的90%以上。　　工业过程中的重要科技基础　　当下，工程热化学领域科技创新的重要性正日益凸显。　　专家认为，工程热化学作为工业过程中重要的科学技术基础，对构建以新能源为支撑的绿色低碳工业体系，推动工业过程流程再造和智能化转型，实现“双碳”目标具有重要意义。　　“以钢铁冶金行业为例，冶炼过程包括铁矿石的预处理、炼焦、炼铁、炼钢、铸造以及轧制等过程，在这一长流程中包含了大量的工程热化学问题。”北京科技大学钢铁冶金新技术国家重点实验室主任郭占成介绍。　　郭占成表示，钢铁冶金作为能源消耗与碳排放重点行业，正在从效率优先向兼顾节能与环境友好转变。钢铁冶炼技术的进步与发展离不开工程热化学基础理论作为科学参考。　　从石化行业来看，中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院院长李明丰分析，随着一系列低碳减排政策的推出，石化行业正在发生从传统能源化工向新型能源化工的绿色转型。石化行业将呈现以石油、天然气、煤、生物质、废塑料、二氧化碳等为原料的多元化供应格局，涉及蒸汽裂解、焦化、热解、氧化、燃烧、干馏等多种热化学反应的工艺过程与工程。　　李明丰认为，梳理工程热化学在石化领域的应用及发展，提出该领域的共性问题，是构建新型现代工程热化学及其创新体系的重要一环。　　“双碳”背景下面临诸多挑战　　“双碳”背景下，工程热化学领域相关技术创新，既面临重大机遇，又面临重大挑战。　　中国科学院院士、中国科学院工程热物理研究所金红光研究员举了一些例子：燃料燃烧反应发生于1000℃—1700℃，但发电系统的最高工作温度仍局限于600℃，高温热能一直未能转化为电能。许光文同时指出，电石、冶金硅、电熔镁砂等的现有生产技术要求1500℃—2500℃高温、大量使用电弧炉加热，金属铝、镁、锌等的生产更需使用高温电解技术，造成能耗高、过程效率低，亟须过程低温化技术，实现直接加热或替代电解的变革性技术，显著推进工业节能和低碳排放。　　此外，有效利用生物基碳燃料或实现碳基产品循环，推动化石碳的利用量大幅减少，也要求产业模式的创新和大规模热解碳化技术的突破；利用“碳”作为反应物的热化学工业过程众多，如基于焦炭的铁矿石碳还原，亟须应用低碳富氢气体甚至零碳的纯氢替代焦炭，这正成为冶金学科的热点和难点。　　“热化学反应相关技术创新，甚至变革性替代，是实现低碳发展的保障。或者说，不解决热化学反应过程中二氧化碳的排放问题，本质上就难以达成碳中和目标。”许光文总结说。