高分辨率纯化

4月末，通用电气医疗集团(GE Healthcare)签署了一项协议，收购细胞成像产品制造商Applied Precision，具体收购金额不详。随着这次收购行动，GE Healthcare有望进入快速增长的细胞成像领域。 　　总部位于华盛顿西雅图郊外的Applied Precision开发并制造高分辨率以及超高分辨率的显微镜仪器，让研究人员能够以其他类型显微镜无法实现的规模来研究细胞过程。 　　一般显微镜所拥有的分辨率能让研究人员观察到200 nm及以上的物体。因此，对于大小在10 nm左右的胰岛素，一般的显微镜是无法看到的。然而，有了超高分辨率显微镜，研究人员就能看到。电镜的分辨率与超高分辨率显微镜相似，但它们不能活体观察细胞，而后者能做到。 　　GE Healthcare负责细胞技术的总经理Amr Abid向国外媒体透露，通过在此水平研究细胞功能，研究人员能够对功能异常细胞的机制有了更深入的了解。他举了一些例子，比如利用超高分辨率显微镜来研究HIV病毒如何穿透细胞，这为新药开发提供了信息。 　　几个世纪以来，科学家们都是利用光学显微镜对肉眼无法看到的结构进行观测，目前光学显微镜已经成为了实验室必备的实验器材之一，但是随着研究的深入，光学显微镜的分辨率已经无法达到科学家们的要求了。2008年，《Nature》杂志将超高分辨率显微技术评为年度技术。 　　Abid估计，如今整个显微镜市场大概在20亿-30亿美元。其中，超高分辨率显微镜占了约20%。Applied Precision和徕卡(Leica)是硬件方面的行业领先者，他们各自的市场份额大约为30%-35%。 　　GE目前不提供超高分辨率显微镜，也不曾开发它们。Applied Precision的产品是对GE细胞分析产品线的很好补充。GE也在探索一些方法，将其现有的细胞研究技术与Applied Precision的仪器捆绑起来。 　　目前，GE在细胞成像方面的旗舰产品是2009年上市的IN Cell平台。IN Cell Analyzer平台提供了一整套从自动化图像获取到数据的定量和深度分析以及可视化的强大工具，来协助整个高内涵分析过程。前不久，GE推出了最新版本的分析平台&mdash &mdash IN Cell 6000。 　　据Abid透露，由于Applied Precision在高分辨率以及超高分辨率显微镜方面声名卓著，故GE打算保留其名称。该公司还计划保留全部130名员工，并在技术上继续投资。 GE还打算加大力度提高Applied Precision在亚太地区(如中国、印度和日本)的知名度，对于超高分辨率显微镜而言，这些区域是一个增长点，然而，Applied Precision目前的份额还很有限。 关于通用电气（中国）医疗集团生命科学部 GE Healthcare Life Science隶属于通用电气医疗集团，我们的产品和技术主要应用于基因科学、蛋白质科学、药物开发研究、以及生物制药、诊断、法医和环保等行业。 我们为制药公司提供完整解决方案，以减少新药筛选和开发的时间和费用，迅速、简单地将研究成果转为规模化生产，并更好地从药物开发候选方案中选择开发出有效、安全药物的方案，更快地研制新药，为医药研发领域的重大突破铺平道路。我们的Biacore和Microcal非标记分子相互作用分析系统是生物分子间相互作用、动力学和热力学研究的标准方法。我们的AKTA系统是专为生物分子纯化而设计的平台，集成了液相层析系统、软件和预装柱；市场上90% 以上FDA批准的生物药正是使用基于相同设计理念的可放大平台AKTAProcess系统和填料进行生物药物分子的提纯。我们的Whatman品牌提供在全球享有盛誉的过滤产品和技术，为分析领域、医疗保健和生物科学市场提供全新的解决方案。 欲了解更多有关GE医疗集团生命科学部的信息，请访问公司网站www.gelifesciences.com.cn，或垂询800-810-9118。

光学显微镜至今已有三百多年的历史，从观察细胞的初代显微镜发展到如今打破分辨率极限的超分辨显微镜。近年来，生命科学领域蓬勃发展，对显微成像技术不断产生新的需求，光学显微镜不断向更高分辨率、快速成像、3D成像等高端技术方向发展。 我国高端光学显微镜市场长期处于被国外产品垄断的局面，许多关键核心部件依赖进口。令人欣喜的是，近五年来，市场上涌现出多种国产高端光学显微镜，包括超分辨显微镜、双光子显微镜、共聚焦显微镜、光片显微镜等，逐渐打破当前市场格局。基于此，仪器信息网特别制作“破局：国产高端光学显微镜技术‘多点开花’” 专题，并向国产光学显微镜企业广泛征稿（投稿邮箱：lizk@instrument.com.cn），了解各企业主要高端光学显微镜产品技术特点和发展进程。本篇为宁波力显智能科技有限公司供稿，公司主要产品为INVIEW iSTORM超高分辨率显微镜，其采用的STORM技术是目前国内鲜少有的超分辨技术类型。撰稿人：宁波力显智能科技有限公司副总经理张猛博士人类的历史，也是一部工具的历史。人类发展的历程就是关于如何对世界了解的更多，将人类生活变的更好更先进的历程。从旧石器时代，原始人拿起第一块石头当作工具开始，就开启了用工具进行未知世界探索和创造性改变的历程。从古至今，人类都是工具发明和使用的种族，新工具的问世也反哺人类的成长和进步，让人类一次次突破原有认知边界看到更多的未知，解决更多的问题，取得更多的成就。显微镜，正是一项帮助人类认识微观世界从而改变世界的革命性工具，也是人类探索微观世界不可缺少的工具。显微镜问世之前，人类仅可用感官来把握世界，所能认识到最小世界就是“目所能及”的常规世界，人的肉眼仅能分辨约0.1毫米尺度的物体，因而相关科学的发展缓慢。当罗伯特胡克使用显微镜观察到软木塞上的“小室”，并将其命名为细胞时，可能还没有意识到他这次实践将为人类开启微观世界的大门。人类对未知领域无限的好奇心是推动科学技术前进的动力之一，为了解析关乎生命基本结构，回答有关物质与生命等基本问题，为此人类不断开发出更为精密、分辨率更高的显微镜来探寻这些问题的答案。经过400多年的发展，近几年国际上出现了超高分辨率显微镜这一工具，一经面世就引起了众多科学家的关注和极大兴趣。那么什么是超高分辨率显微镜，为什么它能让科学家如此感兴趣呢？我们一起往下看。超高分辨率显微镜的诞生，是生命科学史上的一座里程碑简单的讲，超高分辨率显微技术是通过应用一系列物理原理、化学机制和算法“突破”了光学衍射极限，把光学显微镜的分辨率提高了几十倍，使得人类能在200nm以下以前所未有的视角观察生物微观世界的技术，具有超高分辨成像技术和实现超高分辨率成像能力的显微镜就是“超高分辨率显微镜”。那么什么是光学衍射极限呢？所谓光学衍射极限，是1873年德国科学家恩斯特阿贝提出的，由于光是一种电磁波，存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近（小于可见光波长大约一半，约200nm），弥散斑就叠加在一起，看到的就只能是一团模糊的图像，也就无法清晰观测到衍射极限以下物体的微观空间结构。并且光学衍射极限此前长期被认为是限制光学显微镜技术通向更微观的“拦路虎”和“绊脚石”，甚至被科学界一度认为是无法突破或绕开的。直到2000年，几位世界知名科学家先后发明了几种不同技术路线的的超高分辨率显微技术。其中，Stefan Hell、Eric Betzig和W.E. Moerner三位科学家就是因其在超高分辨率显微成像技术领域的突出贡献，获得了2014年诺贝尔化学奖。至此，人类才得以突破光学衍射极限这一横亘在前、不可逾越的“大山”，实现了200nm以下超高分辨率显微成像，以光学的方法观测到纳米尺度世界的真实样貌。超高分辨率显微镜可用来研究分子定位与空间分布、分子相互作用、分子复合物的构成，并可实现分子的计数。除具有200nm以下卓越分辨率性能外，对生命样品结构也可进行精准成像定位，还具备对活体细胞进行微观观察的可能性，对于生物、生命科学、医药、医学等的领域都有着重要意义，因此吸引了全球科学家的持续研究和关注。通常来说，超高分辨率显微镜主要有两大类技术策略，一类是通过特定模式照明对分子受激荧光差异化调制实现超高分辨率成像。代表产品有受激发射光耗损显微镜(Stimulated Emission Depletion, STED)和结构光照明显微镜(Structured Illumination Microscopy, SIM)。另一类，是利用荧光分子的“开关”特性，使其随机闪烁，从而能够对单个分子分别记录，实现超高分辨率成像。随机光学重构显微镜（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）就是这类技术路线的代表。第一大类中，STED及其衍生都是利用“甜甜圈”状的空心光束来修饰位于中间激发光的点扩散函数（Point Spread Function, PSF），从而达到直接超分辨成像的目的。而SIM则是利用了结构光照明，以获得包含样本的结构信息的干涉图案“摩尔条纹”，加上后期的图像重构，达到超分辨成像的目的。第二大类中，STORM是利用了荧光染料分子“光控开关”（photo-switchable）性质，达到在一个衍射极限空间内（200~300 nm）随机“点亮”单个荧光分子并进行高精度定位的目的。既然叫超高分辨率显微镜，最为重要的就是对空间分辨率的提升。其实无论哪一类技术，理论上空间分辨率都是可以实现无穷小，但是受限于样本、荧光染料特性、标记密度、激发光效率等原因，实际拍摄中能实现的空间分辨率是几十纳米。从遍地洋货到国货崛起众所周知，高端显微镜市场被“洋货”所长期垄断，不仅在国外如此，在中国也是如此，国货“芳踪难觅”，这对于我们这样一个大国来说可算是“一言难尽”。当然，也有令人感到振奋的信息，那就是在超高分辨率显微镜这个细分领域，除了“洋货”最近也已见到了国货产品的身影。宁波力显智能科技有限公司（INVIEW）的超高分辨率显微镜产品INVIEW iSTORM就是一款国产超高分辨率显微产品。宁波力显智能科技有限公司是专业从事超高分辨率显微技术和产品研发的科技企业，依托复旦大学的自动控制、新一代信息技术及香港科技大学的生物、光学、图像处理等的技术，拥有光学、生物、自控、机械、信息技术等多领域交叉学科技术团队，将2014年诺贝尔化学奖得奖技术产业化，推出了INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品，以帮助人类以前所未有的视角观察微观世界，突破极限，见所未见。INVIEW iSTORM超高分辨率显微镜产品采用dSTORM技术路线，具有20nm超高分辨率、2-3通道同时成像、界面友好、简单易用、系统稳定性好、环境适应性高等的特点。技术先进，20nm超高分辨率，3D成像采用STORM随机光学重构技术，加入柱面镜设计，在XY轴分辨率达20nm、Z轴分辨率达50nm，具备3D成像功能。多通道同时成像光路设计，稳定性高采用专有的多通道同时成像的光路设计，提供稳定的光路。自主开发的成像分光光路，可保证通道间的光学路径相对独立，使得样品发出的荧光最大效率地被探测器接收，最大限度降低通道间的串扰。并配合以最佳染料方案和最佳成像缓冲液配方，以多通道同时成像的方式，在几秒到十几分钟的时间范围内实现20nm的超高分辨率成像。物理样品锁定设计，锁定精度1nm采用纳米级实时动态锁定技术，以实时物理补偿方式纠正样品漂移，无需预热，即开即用，操作简便，免受如气流、温度变化、噪音、机械振动等的环对样品位置的影响，在高楼层、嘈杂、震动、常温常态的环境下也能稳定成像，因而具有高效、简便、对环境适应性好的特性，友好易用。 “傻瓜式”操作，易学易用软件集成了多种成像算法，并在采集数据时实时呈现超高分辨图像重构结果和详细参数，“所见即所需”，操作流程化，简单易用。具有拍摄过程简单易用、参数优化实时透明、超分辨图像实时重构、自动化用户数据管理、图像数据后分析功能等五大特点。此外，经过优化的样本制备方案更易于实验人员的掌握和实际操作。即便是技术新手，经过简单的技术讲解，2个小时以内就可操控系统并获得理想的超分辨率成像结果。以上，INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品所具备的综合特点和优势，使得它能够帮助到更多科学家进行衍射极限尺度以下的生物分子组织与相互作用等的尖端科学研究。另外，值得一提的是，INVIEW iSTORM产品还以优异的光路、较低强度的照明、多通道同时成像所支持的较短成像时间等的综合性能，结合合适的荧光探针及根据探针特性调整的探测器拍照频率等，实现活细胞的超高分辨率成像，这将更大程度上帮助到科学家在生物学基本问题与机制上的科学研究。随着人类对自然的认识向更加微观的时空尺度，传统的科研手段已经不能完全胜任，没有高端科研仪器，要想做出重大原始创新科研成果很困难。力显智能科技将继续立足于超高分辨率显微镜技术研究及产品开发，不断推出新技术、新品，从而推动高端显微技术在中国的产业化和应用，努力为我国生命科学、医学、药学等领域的科学研究提供强大助力。INVIEW iSTORM超高分辨率显微产品超高分辨率显微技术的未来可期作为一种新兴荧光显微成像技术，超高分辨率显微成像正受到科学家们的广泛关注，实验室中不断产生着振奋人心的数据。围绕着超高分辨率核心，主要研究方向为不断提高显微镜成像性能，使其分辨率更高，成像速度更快，成像深度更深，视野范围更大，及更低的光毒性光漂白。而我们也可以清晰的看到，由于不同的超高分辨率成像技术提升分辨率的技术路径差异，很难有“面面俱到”的技术可以满足差异化样品的全部成像需求，“精准成像”，也就是针对不同的样品特点，而选择最适合这类样品的显微成像技术，是进行生命科学等领域研究的最优解，这也促使生物，光学，算法，图像处理等领域的研究人员不断深入跨学科合作，共同探索生命的奥秘。即便有了更快、更高、更深、范围更大，更低光毒性光漂白的超高分辨率显微镜，扩展应用仍有诸多挑战。细胞内有成千上万的转录本，有数以万计的蛋白分子。超高分辨率显微镜能否用来实现组学水平的多分子检测？能够找到或开发出足够多样的荧光染料以匹配更多分子吗？或者能找到奇方妙法可以实现多重、多轮检测吗？ 能否开发出新型的荧光染料，使其具有更高的光子预算，更好的光稳定性、光激活、光开关以及转换速率等特性；研制更快更灵敏的光子探测器、输出功率更高的激光器；更稳定、高效、智能的光学系统；更加高效的算法以及不同超高技术路线的联合应用；开发组学水平的多重检测方法等等，正有许多的科学家、研究者们正在进行着有益的尝试。相信未来超高分辨率技术应可应用于实现细胞内的原位测序、原位转录组与蛋白质组分析，并最终获得全景的、多组学、全时空细胞全部分子组织及相互作用图像，真正实现分子生物学与细胞生物学的新融合，让人类有更全面、更精细的视角来理解生命的基本分子组织及其运行的基本机制！超高分辨率技术和产品应用前景巨大，未来可期，令人振奋！

作为强大的结构解析工具，冷冻电镜在解析蛋白质结构中具有超强能力。RNA作为另外一种生物大分子，在生命活动中发挥着与蛋白质同等关键的作用，解析它们的三维结构也是科学家们持久探索的问题。但RNA由于分子量小，柔性大等因素，无论是依靠冷冻电镜还是其他结构解析手段，这一目的在往日很难实现。近日，哈佛大学廖茂富博士和尹鹏博士合作，利用ROCK技术改造RNA，赋能冷冻电镜技术，解析了多种RNA的高分辨结构，进一步扩展了冷冻电镜技术的应用场景，也为揭示RNA参与的生命活动，以及围绕RNA的药物开发，打开了全新局面。作为遗传分子DNA的姊妹，RNA支持着我们生活的世界。进化生物学家曾提出假设，认为在DNA和它所编码的蛋白质出现之前，RNA就已经存在并具有自我复制功能。而现代科学发现，只有不到3%的人类基因组被转录成信使RNA(mRNA)分子，并在后续被翻译成蛋白质。相比之下，82%的基因组被转录成具有其他未知功能的RNA分子。为了了解单个RNA分子的功能，在原子和分子键的层面上对其三维结构进行解析是极其必要的。通过对DNA和蛋白质分子进行结晶处理，研究人员已经可以通过X射线晶体学方法或核磁共振方法进行常规的结构研究。然而，由于RNA的分子构成和结构柔性特点，它们往往难以结晶，因此这些需要结晶的方法并不适用于解析RNA分子的结构。 近日，哈佛大学韦斯生物启发工程研究所(Wyss)的尹鹏博士和哈佛大学医学院(HMS)的廖茂富博士合作完成了一项研究，报告了一种对RNA分子进行结构研究的新技术"ROCK"。该技术可以将多个相同的RNA分子组装成一个高度组织化的结构，大大降低单个RNA分子的灵活性，并使其分子量成倍增加。应用于具有不同大小和功能的知名模型RNA作为基准，该团队表明ROCK技术能够将冷冻电镜 (cryo-EM) 方法应用在包含RNA亚基的生物大分子的结构解析上。他们的研究结果发表在《自然-方法》上。 与廖茂富博士一起领导这项研究的尹鹏博士说:「ROCK技术正在打破目前针对RNA进行结构研究的限制，使RNA分子的近原子级分辨率结构得以揭示，这一过程往往难以甚至无法用传统的方法实现。我们期望这一进展能为基础研究和药物开发的许多领域注入活力，包括正在蓬勃发展的RNA疗法。」获得对RNA的控制权 尹鹏博士的研究团队开发了多种方法，包括DNA砖块和DNA折纸术，这些方法使DNA和RNA分子能够根据不同的规则和需求进行自我组装，从而形成超大分子。他们假设，这种策略也能够将自然存在的RNA分子组装成高度有序的环形复合物，通过将特定分子连接在一起的方式，对柔性进行限制。许多RNA以复杂但可预测的方式折叠，在小片段之间进行碱基配对交互。其结果往往会将稳定的 "核心 "和 "茎环 "向圆环外侧凸出。 在ROCK技术(通过吻式发夹实现RNA寡聚化后冷冻电镜结构解析)中，目的RNA被设计成通过吻式发夹序列(红色)自组装成一个封闭的同源环，这些序列定位在在功能非必要的外周螺旋上(蓝色)。在确定了可编辑的非必要外周螺旋后，连接吻式发夹模体和目的RNA核心的螺旋的长度被计算优化。带有目的RNA的多个单独亚基的RNA构建体被转录、组装，通过凝胶电泳纯化，并通过冷冻电镜进行结构解析。 「在我们的方法中，我们构建了吻式发夹，可以将同一RNA两个拷贝的不同外围茎环连接起来，使之形成一个整体稳定的环，其中包含了目的RNA的多个拷贝。我们推测，这些高阶环可以通过冷冻电镜进行高分辨率结构解析，该技术已首次成功应用于RNA分子的结构解析。」 —刘迪，第一作者 描绘稳定的RNA 在冷冻电镜方法中，许多生物大分子的单一颗粒在低温下被瞬间冻结，以阻止它们的运动。随后，在电子显微镜和计算算法的帮助下，对颗粒各个方向的二维表面投影进行比较，以重建其三维结构，实现生物大分子的可视化。彭和刘与廖和他的前研究生弗朗索瓦塞洛(François Thélot)博士合作进行了该工作，后者是该研究的另一位第一作者。廖和他的团队在冷冻电镜领域、以及对特定蛋白质形成的单颗粒的实验和计算分析中做出了重要贡献。 廖茂富说:「与传统方法相比，冷冻电镜在解析包括蛋白质、DNA和RNA在内的生物分子的高分辨率结构细节方面有很大的优势，但是大多数RNA的小分子量和高柔性使其结构难以解析。我们组装RNA多聚体的新方法同时解决了这两个问题，通过增加RNA的分子量，并降低其柔性，我们的方法为基于冷冻电镜方法解析RNA结构这一领域打开了大门。」由于整合了RNA纳米技术和冷冻电镜方法，该团队将这一复合技术命名为"ROCK" (RNA oligomerization-enabled cryo-EM via installing kissing loops, 通过吻式发夹实现RNA寡聚化后冷冻电镜结构解析)。 为了证实ROCK技术的可行性，该团队将研究聚焦于四膜虫(一种单细胞生物)的大内含子RNA和固氮弧菌(一种固氮细菌)的小内含子RNA，以及FMN核糖开关。内含子RNA是散布在新转录RNA序列中的非编码RNA序列，必须被 "剪接"出来才能形成成熟RNA。FMN核糖开关存在于一些细菌RNA中，这些细菌会参与由维生素B2衍生的黄素代谢物的生物合成。在与RNA结合后，黄素单核苷酸(FMN)将切换其三维构象，并抑制其母RNA的合成。 在对四膜虫 I 组内含子的结构解析过程中，研究人员收集了约十万张ROCK技术处理的单颗粒冷冻电镜图像，通过一系列计算分析步骤重建了其结构，整体分辨率达到了2.98Å，结构核心的分辨率达到了2.85Å。最终的模型提供了四膜虫 I 组内含子的详细视图，包括之前未知的外围结构域(以土黄色和紫色显示)，它们构成了围绕核心的条带。 研究小组称，他们将四膜虫 I 组内含子组装成一个环状结构，使样品更加均匀，并能够利用组装结构的对称性来进行计算。虽然数据采集两的规模并不大，但ROCK技术的优势使研究小组能够以前所未有的分辨率解析该结构。RNA的核心结构以2.85Å的分辨率解析，揭示了核苷酸碱基和糖骨架结构的详细特征。研究小组还称如果没有ROCK技术加持，在当前的资源条件下，他们不可能做到这一点。 冷冻电镜还能够捕捉不同构象的分子。研究小组通过将ROCK方法应用于固氮弧菌内含子RNA和FMN核糖开关结构解析中，确定了固氮弧菌内含子在其自我剪切过程中的不同构象，揭示了FMN核糖开关配体结合部位的相对刚性的构象。 这项研究生动演示了RNA纳米技术如何推动着其他学科的发展。将天然状态的RNA分子结构进行可视化，对理解不同细胞类型、组织和生物体的生物及病理过程产生巨大的影响，甚至能够实现新的药物开发方法。 相关文献摘要高分辨率的结构研究对于理解各种RNA的折叠和功能至关重要。在此，我们提出了一种纳米结构工程策略，利用单颗粒冷冻电镜(cryo-EM)对纯RNA结构进行高效的结构测定。即ROCK技术(通过安装吻式发夹实现RNA寡聚化的冷冻电镜技术): 将吻式发夹序列安装到RNA的非必要功能茎上，使其自组装成具有多倍分子量和降低结构柔性的同源封闭环。ROCK技术能够以2.98 Å的整体分辨率(核心部分为2.85 Å)对四膜虫 I 组内含子进行冷冻电镜三维重构，以建立完整的RNA模型，包括以前未知的外围域。ROCK技术被进一步地应用于两个较小的RNA: 固氮弧菌 I 组内含子和FMN核糖开关，揭示了前者的构象变化和后者的结合配体。ROCK技术有望大大促进冷冻电镜在RNA结构研究中的应用。评论来源：Science Dailyhttps://www.news-medical.net/news/20220503/New-method-enables-the-structural-analysis-of-RNA-molecules.aspx文献来源：Nature Methodshttps://www.nature.com/articles/s41592-022-01455-w#citeas水木未来视界丨iss. 18