变异体

血红蛋白（Hb）变异，是一组由珠蛋白基因突变引起的常见遗传性变异，其特征是血红蛋白分子结构发生变化。迄今为止，已鉴定出1300多个变异体，其中，超过150个不稳定的Hb变异体被记录为引起不同严重程度的溶血性贫血的原因。对Hb变异体进一步的研究，可用于新生儿筛查、产前筛查… … 此外，许多研究表明Hb变异可能会对糖化血红蛋白（HbA1c）的测量产生干扰，因此，临床相关Hb变异体的鉴定和表征对于做出正确诊断至关重要。目前，高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳（CE）是HbA1c测量和Hb分析的一线方法。近日，北京大学深圳医院检验科纪玲博士团队使用融智生物科技（青岛）有限公司的QuanTOF发现了一种新的Hb变种，即Hb辽宁，这是国内首次由MALDI-TOF MS鉴定出来的血红蛋白变异体。相关研究结果已经发表在Clin Chem Lab Med 2019上，论文题为“Detection of a novel hemoglobin variant Hb Liaoning by matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry”（https://doi.org/10.1515/cclm-2019-0300）。先证者是来自中国辽宁省的一名36岁汉族男子，被送往北京大学深圳医院进行例行健康检查。首先使用毛细管电泳（CE）分析仪测量HbA1c水平，该分析仪没有产生HbA1c值，非典型电生理图显示无明显异常峰值。电泳软件将配置文件识别为“非典型”，主要是由于存在额外的峰值。因此，研究人员假设Hb变异可能会干扰HbA1c分析。随后，使用高效液相色谱法（HPLC）、硼酸亲和力高效液相色谱法、免疫分析法和MALDI-TOF分析仪分别进一步定量HbA1c。其中，MALDI-TOF分析仪为融智生物科技（青岛）有限公司的新一代宽谱定量飞行时间质谱QuanTOF。 融智生物新一代宽谱定量飞行时间质谱平台QuanTOF HbA1c测试结果分别为：5.2％（33mmol/mol，高效液相色谱法），5.1％（32mmol/mol， 硼酸亲和力高效液相色谱法），4.9％（30mmol/ mol，免疫分析法）和4.9％（30mmol/mol， QuanTOF）。与从硼酸亲和力高效液相色谱法获得的结果比较，观察到高效液相色谱法（2.0％），免疫分析法（-3.9％）和QuanTOF（-3.9％）的可接受偏差（国家糖化血红蛋白标准化计划[NGSP]标准，偏差在±5.0％内）。高效液相色谱法的色谱图未显示变异体。然而，QuanTOF的质谱图显示出异常的Hb链（m/z=15,169.4），相对强度占总αHb的26.0％（图1B）。在谱图中还发现了正常的Hb链，包括αHb亚基（m/z=15,127.9），βHb亚基（m/z = 15,868.0）和糖化-βHb（m/z=16,030.0）（图1A，B）。 对照血红蛋白和Hb辽宁的MALDI-TOF质谱。（A）来自正常成人的对照血红蛋白和（B）来自先证者的Hb辽宁。分开的两个峰质量相差41.5Da，清楚地表明存在变异体α链（m/z=15,169.4）。箭头表示存在正常α链（m/z=15,127.9），正常β链（m/z=15,868.0）和糖化-βHb（m/z=16,030.0）。 使用毛细管电泳（CE）和离子交换高效液相色谱进行随后的Hb分析。令人惊讶的是，没有出现异常峰或非典型色谱图的迹象。研究人员随后进行Sanger测序以确认Hb变异体的存在以及性质。测序数据显示α2基因中存在新的杂合突变[α15（A13）（GGT GTT），Gly Val，HBA2：c.47 G T]，导致甘氨酸的编码转换（分子量：75.1 Da）在密码子15处的缬氨酸（分子量：117.1Da）。如图1B所示，从甘氨酸到缬氨酸（42.0Da）的取代诱导的相对分子量的变化也可以从αHb亚基和变异体Hb亚基（41.5Da）之间的m/z变化中找到。由于以前没有报道该变种，研究人员根据患者所在的地区将其命名为Hb辽宁。 Sanger测序的结果。 Sanger测序揭示了一种新的突变[α15(A13)(GGTGTT), GlyVal, HBA2:c.47 GT]。 为了确定患者与Hb辽宁相关的血液学特征，对其进行血液学数据测量显示，得到的血液学指标并没有发现贫血迹象，这表明患者非病理性Hb变异。Hb变异是溶血性贫血的原因之一，同时也是HbA1c测量中的分析干扰。在本研究的案例中，Hb辽宁没有显示出明显的临床表现。然而，该变异体在使用CE法的HbA1c测量中引起干扰。在以前的研究中，通常使用硼酸盐亲和HPLC方法作为比较方法，因为它无论Hb种类如何都测量总糖化血红蛋白，因而被认为不受大多数Hb变异体的影响。结果中提到的可接受的偏差表明Hb辽宁对高效液相色谱和QuanTOF的HbA1c测量没有显著影响。高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳（CE）是HbA1c测量和Hb分析的一线方法。仅有有限的研究显示了MALDI-TOF MS在HbA1c测量中的应用。在目前的研究中，阳离子交换HPLC和电泳方法在检测Hb辽宁时面临挑战，因为电荷差异不明显且超出检测限。而MALDI-TOFMS能够通过m/z差异区分Hb辽宁。当然了，MALDI-TOF MS可能无法区分所有类型的Hb变异体，尤其是当m/z差异很小且超出仪器分辨率时。最后同样重要的是，鉴定Hb变异和识别HbA1c检测中的干扰是至关重要的，尤其是在Hb变异的高患病率区域。

蛋白新药的设计得益于重组DNA技术的发展。融合蛋白是指通过基因融合两个或更多蛋白质结构域来创造一个具有新功能的嵌合蛋白。每个融合体的功能通常分为一个载体结构域和一个效应结构域，前者有助于提高稳定性和药代动力学，后者具有从细胞毒性到识别和结合等不同的功能。截至2019年，已有11种Fc融合蛋白疗法被FDA批准。 生物制药的电荷变异体（电荷异质性）来自翻译后修饰，如磷酸化、糖基化和脱酰胺化，须在整个生产过程中密切监测，因为它可能影响产品的安全性和有效性。全柱成像毛细管等电聚焦（icIEF）已被证明有诸多良好检测性能特征，如高分辨率、自动化、定量准确、重现性好和易用性。凭借这些优势，它已成为生物制品，特别是单克隆抗体电荷变异体表征的主流技术。 与单克隆抗体等传统生物药相比，融合蛋白的电荷异质性差异更大，这使得表征融合蛋白成为一个挑战。建立一种适用于分析多种融合蛋白的平台方法可以方便方法开发并且简化生产流程。2021年，中国食品药品鉴定研究院（NIFDC）利用全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术的双通道（紫外&自发荧光）表征9种融合蛋白药物的电荷异质性，其中6种蛋白为商业化蛋白。紫外吸收UV280nm是经典icIEF等电聚焦电泳检测通道。自发荧光（NIF：Native Fluorescence）是指利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现检测，无需添加染料。 结果表明，icIEF方法可用于重组蛋白类药物电荷异质性及等电点分析。该方法快速、准确、重复性好，为保障融合蛋白类产品生产工艺的稳定性及质量控制提供了一种可靠的平台分析方法。9种融合蛋白9种融合蛋白治疗剂（在本研究中被命名为样品1-9），其中6种已商业化，包括：样品1：安进公司的依那西普；样品2：百时美施贵宝公司的阿巴泰普；样品3：再生元公司的阿夫利贝特；样品5：重组人肿瘤坏死因子-α受体II：海正药业的IgGFc融合蛋白；样品6：嘉宏药业的康柏西肽；样品7：百时美施贵宝的贝拉塔塞普；三个样品正处于不同临床试验阶段，包括VEGFR-Fc融合蛋白样品4，血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白样品8和胰高血糖素样肽-1-Fc融合蛋白样品9。结果通用稳定剂SimpleSol 大多数融合蛋白在传统电聚焦凝胶电泳（IEF）分析过程中会聚集或沉淀，需要添加剂来保持稳定性。尿素已被证明可以减少蛋白质聚集，并提高IEF分析的重复性。因为本研究的目的是开发一个平台方法，所以需要确定一种能在多种融合蛋白中发挥作用的稳定剂。为此，研究人员比较了尿素和商业稳定剂SimpleSol（来自ProteinSimple）对三种不同的融合蛋白治疗剂（样品1-3）的影响。 在没有稳定剂的情况下，样品1在电泳分析过程中发生聚集，形成不可重复的峰型（图1）。在加入2M尿素的情况下，样品1的峰型重复性得到提升。然而，在有尿素的情况下，峰高明显降低，约为无尿素情况的25%。相比之下，当样品1在含50%的SimpleSol的体系下进行分析时，峰型变得可重复，而且峰高和分辨率都保持不变（图1）。因此，对于样品1，SimpleSol比尿素更适合作为icIEF分析的稳定剂。图1 对于样品2，在没有添加稳定剂的情况下也观察到了聚集现象，导致了峰型的不可重复（图2）。与样品1不同，加入2M尿素并没有改善峰型的分离。只有当加入4M尿素时，峰型才变得可重现。然而，在这两种条件下，峰高和分辨率也都明显降低。在SimpleSol的存在下，峰高和分辨率都得到了保持（图2），再次证明SimpleSol在稳定样品方面优于尿素。对于样品2，SimpleSol同样比尿素更适合作为icIEF分析的稳定剂。数据表明，SimpleSol可以作为一种通用的蛋白质稳定剂用于融合蛋白的icIEF分析方法。图2紫外吸收和自发荧光双通道检测 在紫外吸收检测模式下研究人员分析样品1，样品峰从嘈杂的基线中区分不明显（图3）。为了克服这一挑战，研究人员同时利用自发荧光通道检测。与紫外吸收检测相比，荧光检测的每个峰组都显示出更高的信号，并且荧光检测的基线噪音更小。图3与传统IEF方法对比 icIEF方法与平板凝胶IEF方法产生了相似的峰型（图4）。然而，icIEF方法的每个峰的分辨率均得到了改善。此外，icIEF方法的灵敏度明显高于IEF方法；在获得凝胶IEF结果时，每个泳道要上样大约20μg的蛋白质，而利用icIEF分析时，最终样品溶液进样浓度为0.225μg/μL至0.45μg/μL。每次进样量约为5μL。相当于2.25μg-4.5μg的蛋白质，极大节约了样品。图4. icIEF方法与平板IEF方法检测融合蛋白对比图总结 NIFDC利用ProteinSimple全柱成像毛细管等电聚焦电泳技术建立并证明了用于融合蛋白电荷异质性表征的方法平台。该平台有如下特点： 使用了通用的蛋白质稳定剂SimpleSol，可以有效避免融合蛋白发生聚集或沉淀。对于一些样品，无需任何添加剂就能获得可重复峰型，与没有稳定剂的相同蛋白质的峰型相比，添加这种稳定剂对蛋白质的峰型的不利影响很小。使得该方法可以广泛用于分析多种融合蛋白，而不需要根据不同的样品更换稳定剂。同时可通过紫外和自发荧光双通道来检测蛋白质。自发荧光检测模式利用芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的自发荧光来实现且无需染料，可以提高灵敏度，减少由载体两性电解质引起的背景噪音。通过icIEF分离得到的每个峰组分的峰面积百分比和表观pI值，重复性好。总共对9种融合蛋白药物进行表征，每个组分的峰面积百分比和表观PI值的定量分析都有极佳的重复性。扫描下方二维码，获取ProteinSimple融合蛋白表征解决方案参考文献：1. Wu, Gang et al. “A platform method for charge heterogeneity characterization of fusion proteins by icIEF.” Analytical biochemistry vol. 638 (2022): 114505.关于我们ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-Techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。我们致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助疫苗研发、生物制药、细胞治疗、基因治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题，深度解析蛋白质和疾病相互关系。联系我们地址：上海市长宁路1193号来福士广场3幢1901室 电话：021-60276091热线：4000-863-973邮箱：PS-Marketing.CN@bio-techne.com网址：www.bio-techne.com

大家好，本周为大家分享一篇发表在Chemical Science上的文章，Distinct Core Glycan and O-Glycoform Utilization of SARS-CoV-2 Omicron Variant Spike Protein RBD Revealed by Top-Down Mass Spectrometry1，通讯作者是美国威斯康星大学的Ying Ge教授。　　SARS-Cov-2的快速变异为全球抗疫带来了极大的挑战。Delta和Omicron等新变种的传染性更强、病症更严重、显著逃避康复者或疫苗的中和抗体，并且逃避检测的风险更高。与野生型(WT)毒株相比，Omicron变体具有数量惊人的突变(30)，包括棘突蛋白受体结合域(S-RBD)中的15个位点突变。S-RBD是中和抗体和其他疗法的主要靶点，病毒的细胞感染性、保护表位免受抗体中和及与人类受体ACE2结合的能力与S蛋白的糖基化密切相关。S蛋白O-聚糖具有巨大的微观异质性和结构多样性，因此对其O-糖基化的表征仍具是极大的挑战。作者在本文中报道了一种自上而下的混合质谱方法，能够同时表征分子结构、位点特异性、各种糖类的相对丰度，以及不同共现蛋白型的整体翻译后修饰(PTM)。　　与WT相比，Delta和Omicron变体固有的突变差异在其RBD中尤其明显(图1A)。为了阐明各种S-RBD的分子序列和O-聚糖，作者使用PNGase F从S-RBD中完全去除N-聚糖，以最小化N-聚糖异质性造成的干扰(图1B)。与完全糖基化的S-RBD相比，N-聚糖的去除产生了10 kDa的分子量损失。通过超高分辨率12T FTICR-MS可实现各种S-RBD的基线同位素分离。自上而下的MS分析显示，各种O-糖型的化学计量比和相对丰度存在显著差异，其中Omicron变体显示出最大的O-糖型结构异质性(图1C)。　　图1 由WT、Delta和Omicron变体产生的S-RBD的蛋白质突变图谱和高分辨率自上而下MS。(A)SARS-CoV-2基因组结构和S-RBD变体蛋白质序列变化的说明。(B)PNGase处理前(-)后(+)的S-RBD的SDS-PAGE。(C)在对WT、Delta和Omicron变体进行PNGase F处理后，完整S-RBD蛋白型的原始MS1。所有确定的O-糖型在插图中用红色圆圈注释。　　为了实现深入的糖型和糖位点分析，作者利用捕获离子迁移谱(TIMS)-MS，通过timsTOF Pro仪器分离和分析各种S-RBD O-聚糖结构(图2)。为了表征Omicron变体的聚糖结构和占比，作者对单个S-RBD O-糖型进行了特异性分离。以最丰富的O-聚糖(26+，1069.4.3 m/z)为例，从Bruker数据分析软件输出由CAD获得的MS/MS片段离子，并使用MASH Explorer16在靶向蛋白质分析模式下进行分析，以进行全面的蛋白型表征。获得了自上而下的MS/MS谱以及各种O-聚糖结构的离子迁移率分离，以克服O-聚糖分析固有的质量简并性和微观异质性(图2B)。足够软的TIMS淌度池活化参数能够对分离的S-RBD蛋白型进行详细的中性缺失图谱绘制，并揭示了具有GalNAcGal(NeuAc)2结构的核心1(Galβ1-3GalNAc-Ser/Thr)O-聚糖(图2C)。这种TIMS-MS方法允许对聚糖结构进行直接表征，以揭示在三种S-RBD变体中具有核心1和核心2(GlcNAcβ1-6 (Galβ1-3) GalNAc-Ser/Thr)O-聚糖结构的多个S-RBD糖型。　　图2 S-RBD O-糖型的TIMS-MS分析。(A)经PNGase F处理后的特定S-RBD糖型(z=26+， 1069.4 m/z)的TIMS-MS分离示意图。插图为前体离子分离后对应的离子迁移率热图。(B) 分离的蛋白型经CAD碎裂后，Omicron S-RBD O-聚糖的自上而下MS/MS。(C) Omicron S-RBD蛋白型中性缺失O-聚糖图谱。　　随后，作者进一步描述了S-RBD WT、Delta和Omicron O-糖基化模式，以揭示变体之间的所有O-糖基化结构改变(图3)。有趣的是，与WT或Delta变体相比， Omicron中主要的O-聚糖微观异质性发生变化。特别是Omicron的核心2 O-聚糖结构丰度显著增强，多重唾液酸化GalNAc(GalNeuAc)(GlcNAcGalNeuAc)和岩藻糖基化GalNAc(GalNeuAc)(GlcNAcGalFuc)结构显著表达。表1总结了Omicron与WT或Delta变体相比所观察到的显著分子丰度差异。　　图3 S-RBD变体的O-糖型表征。S-RBD蛋白型的去卷积谱显示了WT(绿色)、Delta(蓝色)和Omicron(粉色)变体的所有主要O-聚糖分配。理论同位素分布由红点表示。聚糖结构在用插图所示的图形表示。　　表1 S-RBD变体O-糖型相对丰度总结　　Omicron变体的核心1与核心2 S-RBD O-聚糖结构的相对丰度比约为71:29，核心1 GalNAcGal(NeuAc)2是最丰富的O-糖类(~69%相对丰度)。有趣的是，WT和Delta变体显示出对核心1型O-聚糖结构的强烈偏好，其O-糖型丰度的80%以上对应于核心1结构 含核心2 GalNAc(GalNeuAc)(GlcNAcGalFuc)结构的O-聚糖占其总O-糖型组成的13%以上。在WT和Delta S-RBD变体中也发现了这些特殊的核心2结构，但相对丰度要低得多(5-7%)。图3所示的高分辨率完整S-RBD糖型表征表明，与基于糖肽的自底向上MS方法相比，这种自上而下的MS方法具有明显的优势。　　作者进一步研究了S-RBD变体之间的糖基化位点及其微观异质性。对S-RBD O-糖型的详细自上而下MS/MS分析显示，存在一种新的O-糖位点(Thr376)，这是Omicron变体所特有的(图4A)。令人感兴趣的是，所有检测到的WT和Delta变体的S-RBD O-聚糖都被自信地单独分配给Thr323(图4B-C)，这与之前关于WT S O-糖基化的研究一致。鉴于Delta上的突变数量比Omicron少，因此O-糖位点Thr323在Delta和WT变体之间保持保守也就不足为奇了。另一方面，Omicron变体产生了熟悉的Thr323 O-糖位点和一个新的Thr376 O-糖位点(b6012+和b525+)，对应于核心1 O-糖型(图4D)。该Thr376 O-糖位点在残基373处与脯氨酸相邻，这与先前关于脯氨酸附近O-糖基化频率增加的报道一致。这种特殊的Pro373是Omicron变体特有的位点特异性突变，很可能是产生这种新O-糖位点的原因。实验还发现，与T323相比，Thr376位点的占有率较低(30%)，并且仅被可靠地分配给丰富的核心1 O-糖基。此外，尽管为变异体指定的O-糖型是HEK293细胞表达的S-RBD特有的，但已知HEK293表达模型可反映病毒体预期的糖基化位点。　　图4 通过自上而下的MS/MS进行S-RBD O-糖定位。(A)对应于WT、Delta和Omicron S-RBD变体的核心1型聚糖的片段映射。蓝色N表示PNGase F处理后的脱酰胺作用。特定的Omicron残基突变用粉红色表示。(B-D)代表性的自上而下MS/MS CAD片段离子，包括完整的(B)WT(b71+和b17311+)、(C)Delta(b71+和b22312+)和(D)Omicron(b51+、b182+、b71+、b17311+)变体。WT和Delta变体在Thr323处显示完全的O-糖苷占据。发现Omicron变体同时具有Thr323(b51+和b182+)和Thr376(b71+和b17311+)。　　本文首次阐明了SARS-CoV-2 Omicron和Delta变异体中发现的O-糖型结构异质性。与WT或Delta相比，Omicron变体的核心2型O-糖型的利用率显著提高。此外还鉴定了一种新的Omicron S-RBD特有的Thr376 O-糖位点。这种自上而下的MS方法是对传统结构方法的补充，并为SARS-CoV-2 S-RBD蛋白形式的表征提供了无与伦比的分辨率。　　撰稿：夏淑君　　编辑：李惠琳　　文章引用：D.S. Roberts, M. Mann, B.H. Li, et al., Distinct core glycan and O-glycoform utilization of SARS-CoV-2 Omicron variant Spike protein RBD revealed by top-down mass spectrometry, Chemical Science (2022).