分钟检测

新冠疫情的爆发，使得全球卷入了这场没有硝烟的战斗中，相较2021年，疫情虽正在往好的方向发展，但全球确诊人数依然超过5.4亿1,2。等温扩增核酸检测是确诊 SARS-CoV-2 感染的最主要依据。目前可用于 RNA 病毒的核酸检测技术主要有基因测序、聚合酶链式反应（PCR）、等温核酸扩增等。其中荧光定量PCR检测方法是首选方案3。然而反转录实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）的检测方法需要依赖温控精度良好的热循环仪，并且PCR反应中必须的变性、退火和延伸步骤，使整个扩增检测时间较长，难以实现对SARS-CoV-2的现场快速检测4。核酸等温扩增技术无需热循环仪，扩增反应效率高、速度快，非常适合于病原体核酸的现场快速检测。因此不少相关从业人员，都曾把核酸快速检测的希望，寄托于等温扩增技术上面。不同等温扩增技术优劣不少核酸等温扩增方法已相继被用于SARS-CoV-2的检测。包括依赖核酸序列的扩增技术（NASBA）、重组酶聚合酶扩增技术（RPA）、环介导等温扩增技术（LAMP）、交叉引发扩增技术（CPA）、切刻内切酶核酸扩增反应（NEAR）等。这些技术原理各异，产物检测方法各不相同，造成它们在检测SARS-CoV-2时的灵敏度、特异性、靶标基因、所需仪器、检测时间等方面存在差异。市面上这几种等温扩增的方法各有优缺点，以下来分析SAT是在 NASBA 技术的基础上，进一步提高了检测的灵敏度和特异性，但是并未能从根本上克服NASBA 技术反应时间长的问题。 荧光RT-RAA法：荧光RAA方法灵敏度较高。但是对样品核酸品质要求较高，需要搭配传统的提取方法。并且样品同一时间只能检测单一靶标基因。 CPA实时荧光法：CPA扩增产物采用分子信标进行检测，然而这个方法的通量太小。此外交叉引物的设计要求较高，在研发过程中，引物的筛选和测试，十分繁琐。这可能会造成基于该技术的检测试剂平台开发周期较长4 。LAMP芯片法：可利用肉眼观察颜色变化，或灰度检测来判读检测结果，虽然降低了对仪器设备的要求，适合在资源有限和经济不发达地区开展核酸检测，然而主观判断颜色变化存在较大个体差异5，有可能影响结果判读。此外国外，曾经有相关研究人员就新冠病毒检测，针对LAMP 实验方法，以及商品化新冠检测试剂盒的作一个对比，对不同浓度的阳性样品进行检测对比，结果如下表所示6:结果显示在中低浓度的阳性样品中，LAMP法与荧光定量PCR对比，阳性检出率较低，而且检测下限也较差。除了上述提到的情况外，等温扩增还有以下一些问题1、样品前处理（核酸提取）是等温扩增一个主要制约因素。2、如何实现单管闭管条件下的多重或多靶标等温扩增检测，并同时具有高灵敏度和特异性，也是亟待解决的技术难题。3、在理论上等温扩增技术不能够通过反应时间来指示核酸扩增量，这难以实现精准的定量检测，更加适合于半定量或定性检测。4、某些等温扩增方法，如 LAMP 等温扩增涉及多个引物，往往需要通过优化引物设计来确保核酸检测的特异性与灵敏度，这提高了其技术实现难度8。现阶段而言，某些等温扩增技术具有一定现场应用的前景，然而目前的产品通量偏低，时间偏长和灵敏度偏低，还是限制了这项技术的应用场景7。这些缺点限制了等温扩增的发展，也造成了等温扩增技术空有好的设想却迟迟无法落地的困境。那有没有既兼具了等温扩增快速、仪器简单的特点，而又有传统荧光定量PCR特异性好、准确度高的检测方法？答案是有的。快速荧光定量PCR就是这个问题的终极解决方法。它既有传统荧光定量PCR准确度高，灵敏度好的特点，而又通过技术革新，具备比等温扩增更快速完成实验的能力。革新传统的荧光定量PCR实验时间长，是由于受到仪器升降温速度，以及传热的效率所限，整个实验时间时长一般为70-120分钟。一般来说，荧光定量PCR反应的温度条件是较为固定的，既然无法改变温度条件，若想提高整个实验的速度，那么只能从两方面着手进行优化：一是提升温控性能，二是提高热传递效率。百泰克公司历时三年研发的PCR仪，就是从这两方面入手，打破传统荧光PCR反应时间的枷锁，为整个荧光定量PCR技术带来革新。百泰克快速荧光定量PCR仪BTK-8，采用先进的升降温模块，升降温可达12℃/s，平均升降温速度为10℃/s，为传统荧光PCR仪的3-5倍。由于变温PCR反应时，温度需要从58℃提升至95℃，再降至58℃，如此循环40~45次，因此升降温速率的提升可将原本70-120min的检测提速至20~30min完成。耗材方面，BTK-8摒弃了传统的0.1ml、0.2ml PCR反应管，采用新型的注塑工艺与柔性膜结合技术，研发芯片式反应耗材，适合大规模机械化生产，成本进一步降低。单个芯片包含有10个独立的样品孔，芯片加样孔较小，不容易与空气进行交换，从而大大降低了孔洞间的气溶胶交叉污染的可能性，检测体系具有超高的检测准确性，可达到ABI Q6同等灵敏度，且芯片加样无需离心去掉气泡，操作起来更加便捷。 从下表可以看出，现在BTK-8这款快速定量PCR仪，已经能把实验时间压缩至30分钟以下，而且检测下限能够达到200 copies/ml，能满足现在的检测需求。相比于等温扩增技术，快速荧光PCR的时间更短、准确性更高。结语在过去的时间内，等温扩增技术凭借其简单快速、便于在基层单位推广的特点，在部分人畜共患病、妇科恶性肿瘤、以及多种呼吸道疾病的检测中发挥着一定的作用。然而伴随着BTK-8快速荧光PCR仪的横空出世，使得相关的检测有了一个更好的选择。能提供更快捷、准确实验结果的快速荧光定量PCR仪，将会完美替代等温扩增的检测手段，在多个领域中发挥巨大作用。特别是在新型冠状病毒疫情仍然全球流行的时期，由于各国防控情况不平衡，新型冠状病毒或将在相当长的一段时间内与人类共存，甚至有可能会成为一种长期存在的一种呼吸道传播病原体。而在口岸快速排查，基层发热门诊快速分流的实际需求，均要求能够提供快速、准确、有效的实验检测结果。相比于等温扩增技术、BTK-8快速荧光PCR仪则更能满足这些场景的需求。

近日，来自加州大学洛杉矶分校的研究人员魏芳及其合作者开发出了一种迅速、经济、简单的方法，用以检测乳制品或食品中是否含有三聚氰胺，完成该项检测只需短短的15分钟。这项成果被发布在了国际权威期刊《应用物理快报》上。 　　《北京科技报》：通常运用哪些方法来检测三聚氰胺? 　　魏芳：三聚氰胺是一种用于塑料和肥料的工业物质，如果混杂在食品里，将危害人体的健康，因此，快速地将其从食品中检验出来就显得尤为重要了。目前，最常用的方法是色谱法。由于食品分子中的化学性质和物理结构各不相同，所以它们在检测介质上的流动速度也会不同。依据这个原理，我们可以把三聚氰胺和其他物质分离，随后将测得的三聚氰胺值与质谱标准值进行比对，以确定其含量是否超标。这个方法的精准度非常高，远远超过国家要求的最低百万分之二的误差限。但由于检测需要昂贵复杂的仪器，同时检测时间也很长，通常只在一些质量检测中心使用。 　　还有一种比较常用的方法是酶联免疫吸附测定法，其原理是用酶与三聚氰胺反应，对检测过程中产生的有色物质进行定量、定性分析。但由于酶活性很强，如果在保存和运输过程中一旦出现纰漏，将会影响到检测结果，因此对于非专业人员在操作上难度很大。 　　《北京科技报》：新创的15分钟的检测法是怎样的? 　　魏芳：我们的实验以牛奶为样本。过程分为三步，主要包括5到12分钟的分离过程和小于1分钟的变色沉淀反应。首先，将可能干扰三聚氰胺检测结果的杂质从牛奶中分离。然后，向溶液中加入金纳米颗粒。金纳米颗粒可以细微到几纳米，确保了牛奶中的三聚氰胺分子不“漏网”，当它与三聚氰胺相互作用时，会导致溶液的颜色发生显著的变化。最后，再加入三聚氰酸，将变色的纳米颗粒沉淀析出。 　　《北京科技报》：新方法节省时间，但准确率能否保证? 　　魏芳：灵敏度是检测实验准确率的衡量标准之一，它与误差值紧密相连。灵敏度越高，误差值越小。新方法使用便捷，灵敏度略低于传统方法，但仍超过国家最低误差限额百万分之二。我认为此方法的意义不在于代替传统方法，而是提供一种方便快捷的初筛方式。比如，市场或超市的管理人员可以通过这种便捷、小巧的手执式装置，迅速对食品中是否含有三聚氰胺进行测定。 　　《北京科技报》：新方法能否在市民家中应用? 　　魏芳：这种新的测试方法最大的优势在于不需要专业仪器，免除了实验室繁冗的检测流程，同时，检测结果在15分钟内就可读取，肉眼即可确定检测结果。我们希望这次的研究可以迅速在家庭检测中普及，并扩展到检验任何食品。目前，乳制品、鸡蛋、大米浓缩蛋白等食品中都曾被查出含有三聚氰胺，安全现状不容乐观。希望在不久的将来，新妈妈就能在家中使用金纳米颗粒检测方法，对宝宝食用的乳制品以及其他婴儿食品进行检测，确保其中不含三聚氰胺。

近日，由厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室承担的该省科技重大专项前期研究项目“福建沿海有害赤潮生物检测的关键技术研究”通过了专家验收。该项目开发的两种试剂盒，在5分钟内即可检测出赤潮藻。专家认为，该项技术将有效提高我国沿海有害赤潮的监测水平，对赤潮灾害的预警与防治具有重要意义。 有害赤潮是指赤潮藻在短时间内快速繁殖和聚集，对海洋环境和渔业资源造成危害的一种生态现象。有害赤潮藻或释放毒素，或在衰败过程导致水体缺氧，致使鱼、贝类死亡。 福建省科技厅有关负责人告诉记者，福建是我国赤潮的高发区，厦门、闽江口等海域还成立了国家级赤潮监控区，开展高频率、高密度的监测。长期以来，传统的赤潮检测方法是通过显微镜进行人工辨认和计数。这种方法不仅费时，而且对形态相近的赤潮生物难于分辨（如有毒和无毒株系），十分不利于赤潮减灾防灾。 据项目负责人黄邦钦教授介绍，他们瞄准国际赤潮藻检测的前沿技术，相继开发了一系列分子探针技术，如脱氧核糖核酸探针、细胞凝集素探针、肽核酸探针和蛋白免疫荧光探针等。 在现场实验中，这些探针能检测出90％以上的有害目标赤潮藻，甚至1毫升海水中含有1个有害目标赤潮藻也能被检出，指标已达到当今国际先进水平。在此基础上，他们还开发了两种试剂盒，操作简便，每个样品的最短检测时间仅需5分钟。目前该项目已申报专利3项，其中发明专利2项。